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Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article

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Les vaccins anticancéreux doivent activer plusieurs types de cellules immunitaires pour être efficaces contre les tumeurs agressives. Nous rapportons ici l'impact de la présentation structurelle de deux peptides antigéniques sur les réponses immunitaires aux niveaux transcriptomique, cellulaire et de l'organisme. Nous avons utilisé des nanoparticules d'acide nucléique sphérique (SNA) pour étudier comment la distribution spatiale et le placement de deux classes d'antigènes affectent le traitement des antigènes, la production de cytokines et l'induction de la mémoire. Comparé aux SNA à antigène unique, un seul SNA à double antigène a provoqué une augmentation de 30% de l'activation des lymphocytes T spécifiques à l'antigène et une multiplication par deux de la prolifération des lymphocytes T. Le placement de l'antigène dans les SNA à double antigène a modifié l'expression génique des lymphocytes T et la croissance tumorale. Plus précisément, les SNA à double antigène encapsulant des antigènes ciblant les cellules T auxiliaires et avec des antigènes conjugués de manière externe ciblant les cellules T cytotoxiques ont élevé les voies génétiques antitumorales, bloquant les tumeurs lymphomateuses chez la souris. De plus, lorsqu'il est combiné avec l'inhibiteur de point de contrôle anti-programmed-cell-mort protein-1 dans un modèle murin de mélanome, un arrangement spécifique d'antigène dans les SNA à double antigène a supprimé la croissance tumorale et augmenté les niveaux de cellules T mémoire circulantes. La conception structurelle des vaccins multi-antigènes a un impact considérable sur leur efficacité.

La vaccination est une stratégie attrayante contre les cancers exprimant des antigènes et des néo-antigènes associés aux tumeurs ciblables. Pour le mélanome, des efforts croissants ont été déployés pour développer des vaccins ciblant des protéines identifiées associées aux tumeurs (par exemple, gp100, MAGE-A3, MART-1 et NY-ESO-1)1,2,3,4. Cependant, bien que ces vaccins procurent certains avantages (tels que l'augmentation des lymphocytes T activés spécifiques au mélanome), beaucoup sont conçus pour activer principalement les lymphocytes T cytotoxiques. Les tumeurs peuvent présenter une hétérogénéité considérable et des charges mutationnelles élevées5,6 qui permettent d'échapper facilement à la surveillance immunitaire7. Ainsi, les vaccins qui reposent principalement sur l'activité des lymphocytes T cytotoxiques sont inadéquats, nécessitant des vaccins contenant des antigènes ciblant plusieurs types de cellules immunitaires pour induire une rémission tumorale améliorée.

Les approches courantes pour déclencher une réponse immunitaire à multiples facettes comprennent l'administration de « longs peptides » dont la séquence couvre plusieurs épitopes pour activer à la fois les cellules T cytotoxiques et auxiliaires, ou de plusieurs antigènes peptidiques « minimaux », chacun unique aux sous-classes de cellules T8,9,10,11. Cependant, bon nombre de ces efforts en cours impliquent des pools de peptides, avec ou sans adjuvant, délivrés dans une solution saline sous forme de mélange. Récemment, de simples changements apportés à l'administration des composants du vaccin à l'aide de liaisons chimiques de base12 ou de la nanotechnologie13,14,15,16 ont montré le potentiel de la structuration des vaccins pour améliorer la puissance. Ce concept, appelé «vaccinologie rationnelle», offre une voie pour optimiser structurellement le placement d'antigènes ciblant plusieurs types de cellules immunitaires dans un vaccin pour une large immunité antitumorale.

Dans ce travail, nous explorons l'espace de conception de vaccins impliquant plusieurs antigènes ciblant les cellules. En employant des changements structurels dans le placement de l'antigène, nous élucidons l'impact de la réponse immunitaire résultante et l'exploitons pour favoriser le succès des efforts de traduction. Les antigènes utilisent des lymphocytes T cytotoxiques activés (CD8+) pour tuer efficacement les tumeurs, ainsi que des lymphocytes T auxiliaires (CD4+) pour synergiser les interactions immunitaires pour un rejet tumoral de longue durée17,18. Les lymphocytes T CD4+ maintiennent la fonctionnalité CD8+ dirigée vers la tumeur en les recrutant sur le site tumoral et en améliorant leur prolifération et leurs fonctions effectrices19,20,21,22,23. Par conséquent, les vaccins de ce travail considèrent le placement structurel précis des cibles antigéniques du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC)-I-restreint et du MHC-II-restreint (CD8+-activant et CD4+-activant, respectivement) pour amorcer le système immunitaire le plus efficacement.

Ici, nous utilisons la plate-forme d'acide nucléique sphérique (SNA) pour élucider l'effet de la structure à l'échelle nanométrique sur les processus immunologiques multi-antigènes. Le SNA comprend un noyau de nanoparticules (tel qu'un liposome) avec une surface dense et disposée radialement d'oligonucléotides. Les SNA sont des outils puissants pour explorer ces relations complexes en raison de leur biocompatibilité24, de leur capacité à pénétrer rapidement dans les cellules en grande quantité25,26, de leur puissante activation immunitaire lors de l'utilisation de l'ADN agoniste du récepteur de type péage 9 (TLR9) comme coque27 et de leur modularité, qui permet le placement défini à l'échelle nanométrique de composants utilisant une chimie bien connue28,29,30. Dans ce travail, nous montrons comment la structure des vaccins SNA portant plusieurs antigènes peptidiques ciblant les cellules immunitaires influence grandement l'activation immunitaire. La modification de la position du type d'antigène dans le SNA modifie le traitement des cellules dendritiques, régule à la hausse les voies des cellules immunitaires au niveau du transcriptome, améliore la production et la sécrétion de cytokines et de marqueurs de mémoire au niveau cellulaire et ralentit la croissance tumorale au niveau de l'organisme. Collectivement, ces changements définissent la puissance du vaccin contre un modèle agressif de tumeur de mélanome B16-F10 et, surtout, élucident les idées de conception concernant le placement de plusieurs antigènes peptidiques qui peuvent se traduire par d'autres thérapeutiques et guider leur développement.

Nous avons cherché à déterminer les conditions optimales de traitement des antigènes pour les vaccins SNA multi-antigènes afin de générer des réponses robustes des lymphocytes T cytotoxiques et auxiliaires. En particulier, nous avons étudié comment la livraison de peptides pour deux classes d'antigènes (MHC-I-restreint et MHC-II-restreint) aux cellules dendritiques (CD) modifierait le traitement in vitro. Les CD sont des cellules présentatrices d'antigène professionnelles essentielles qui induisent une signalisation pour un amorçage efficace des lymphocytes T. Des travaux antérieurs ont montré le potentiel d'amélioration de l'activation des CD par la délivrance simultanée d'antigènes cytotoxiques et auxiliaires31,32, mais aucun n'a eu de système capable de comprendre la meilleure façon de présenter de tels antigènes. Nous avons émis l'hypothèse que la livraison simultanée des deux classes d'antigènes sur la même nanoparticule, par opposition à leur livraison sur différentes nanoparticules, améliore l'activation des deux types de lymphocytes T, et que l'emplacement structurel des antigènes a un impact marqué sur les performances du vaccin.

Pour tester cette hypothèse, nous avons conçu et synthétisé des vaccins SNA à double antigène (DA-SNA) contenant à la fois des antigènes restreints au MHC-I et restreints au MHC-II à différents endroits à l'échelle nanométrique (appelés DA-SNA 1 et DA-SNA 2, basé sur le placement de chaque antigène; Fig. 1a). En raison de la modularité des SNA, il existe plusieurs emplacements différents dans la construction SNA où les antigènes peuvent être placés. Pour ce travail, les arrangements d'encapsulation et d'hybridation pour le placement de l'antigène ont été sélectionnés et comparés les uns aux autres. Pour évaluer comment la distribution des antigènes et l'administration sur différentes nanoparticules affectent l'activation immunitaire, des formulations contenant deux SNA individuels, chacun ne présentant qu'une seule classe d'antigènes dans la même position que dans le vaccin DA-SNA, ont été synthétisées (Fig. 1 supplémentaire). Les formulations ont été qualifiées de « séparées » pour les SNA individuels délivrant un seul antigène et « combinées » pour le double antigène contenant le DA-SNA.

a, vaccins SNA à double antigène (DA-SNA) synthétisés pour modifier le placement des antigènes restreints au MHC-I et restreints au MHC-II dans la même structure de nanoparticules. b, L'expression (mesurée par MFI) des marqueurs de co-stimulation CD80 (à gauche) et CD86 (à droite) sur les DC CD11c + basée sur la livraison des deux classes d'antigènes sur des nanoparticules séparées (en pointillés, séparés) ou un DA-SNA singulier (solide, combiné). c, lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène OVA1 (à gauche) ou lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'antigène OVA2 (à droite) issus d'une co-culture de DC pulsées par traitement avec des lymphocytes T spléniques naïfs. d, MFI du signal du marqueur d'activation de CD69 dans la population de lymphocytes T CD8 + (à gauche) ou CD4 + (à droite) spécifiques de l'antigène. e, changement de pli dans la prolifération des lymphocytes T à partir de splénocytes OT1 spécifiques de l'antigène OVA1 après co-culture avec des DC pulsées par le traitement. Pour tous les panels, moyenne ± sem indiquée, ainsi que la signification statistique entre les comparaisons pertinentes. La signification a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Sidak, avec n = 3 à 4 répétitions par groupe. NS, non significatif.

Pour synthétiser les DA-SNA, un peptide d'une classe d'antigènes a été encapsulé dans des liposomes de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) de 50 nm au cours de leur formation (Figs. 2 et 3 supplémentaires). En parallèle, le peptide de l'autre classe d'antigènes a été conjugué à un brin complémentaire de la coquille d'ADN adjuvante du motif CpG («complément CpG») du SNA en utilisant la formation de liaisons disulfure (Fig. 4 supplémentaire). Les séquences d'ADN et de peptides utilisées dans ce travail se trouvent dans les tableaux supplémentaires 1 et 2. Un duplex hybride a été formé en refroidissant lentement le complément CpG avec un antigène attaché à un brin CpG complémentaire à terminaison 3'-cholestérol. Le fragment cholestérol ancre le duplex à la surface du liposome. Il a déjà été démontré que ces deux brins se duplexent efficacement à des températures inférieures à ~56 °C33,34. Ce produit hybride a été ajouté aux liposomes pour obtenir une quantité équimolaire de chaque antigène. La surface du liposome a été remplie avec de l'ADN T20 non ciblant qui ne contenait pas d'antigène pour obtenir 75 brins d'ADN au total par liposome, ce qui équivaut à une densité de 1,6 pmol cm-2 à laquelle les propriétés associées aux SNA qui les rendent utiles en biologie sont observées16. Les SNA contenant soit un seul antigène encapsulé, soit un seul antigène hybride (les formulations "séparées") ont été synthétisés selon les protocoles précédents16. La formation de SNA a été confirmée à l'aide de la diffusion dynamique de la lumière (Fig. 5 supplémentaire) et la stabilité des nanostructures a été maintenue pendant 45 jours (Fig. 6 supplémentaire).

Une fois ces différentes structures synthétisées, leur capacité à amorcer les DC a été évaluée en utilisant des antigènes modèles restreints au CMH-I et au CMH-II de l'ovalbumine (OVA), appelés respectivement OVA1 et OVA2. L'activation des signaux de DC et la capacité d'amorcer les lymphocytes T ont été caractérisées à l'aide de DC dérivées de la moelle osseuse murine (BMDC) et d'antigènes délivrés sous forme de deux structures SNA distinctes par rapport au vaccin combiné DA-SNA. Une incubation d'une nuit de BMDC avec les différentes dispositions structurelles du vaccin a montré que le pourcentage de DC CD11c + exprimant les marqueurs de co-stimulation innée CD86 et CD80 ne changeait pas de manière significative (Fig. 7 supplémentaire). Ceci est probablement attribué au fait qu'une incubation prolongée peut conduire à des niveaux équivalents de délivrance d'adjuvant entre les formulations combinées et séparées et indique que l'hybridation à CpG n'interfère pas avec l'activation de TLR9. Pour maximiser les différences et évaluer l'impact de la cinétique précoce sur l'activité immunostimulatrice et l'expression des marqueurs de co-stimulation, nous avons pulsé les DC avec les différentes formulations structurelles pendant 30 min et remplacé les médias avant de laisser le temps aux DC d'exprimer les signaux de co-stimulation. Les résultats (Fig. 1b) illustrent que l'arrangement des antigènes avec OVA1 hybridé et OVA2 encapsulé dans des nanoparticules séparées ou une seule construction DA-SNA conduit à une expression significative de CD80 et CD86. Lors de l'analyse d'une gamme de doses, une expression élevée de CD80 et CD86 se produit lorsque des concentrations plus élevées sont utilisées, et cela n'est pas dû à une interaction préférée du CMH-I avec le peptide qui pourrait conduire à une internalisation améliorée. Cette tendance se manifeste également, bien que dans une moindre mesure, lors de l'utilisation de SNA contenant un ensemble différent de peptides (Extended Data Fig. 1). La présentation des antigènes aux lymphocytes T spléniques naïfs pour élever des lymphocytes T spécifiques de l'antigène, un indicateur de la capacité du système immunitaire à reconnaître les antigènes tumoraux35, n'a pas été affectée par la manière dont les antigènes étaient disposés ; les cellules T naïves ont pu se développer par clonage dans des cellules T spécifiques à OVA1 et OVA2 (Fig. 1c; stratégie de déclenchement dans la Fig. 8 supplémentaire). En effet, ~ 0, 6 à 0, 7% de la population vivante de CD19− était doublement positive pour le dimère OVA1-H-2kb et le marqueur CD8 +. Des tendances similaires ont été observées pour la différenciation des lymphocytes T spécifiques à OVA2, avec environ 0, 9 à 1, 1% contenant des marqueurs doublement positifs pour le tétramère OVA2-H-2-Iad et l'anticorps CD4 +. Seules les structures DA-SNA, et non les formulations séparées, étaient capables d'élever de manière significative la quantité de lymphocytes T spécifiques de l'antigène au-dessus de celle de la ligne de base du contrôle des lymphocytes T ; cela suggère que la délivrance combinée des deux antigènes aux DC conduit à une différenciation plus forte des lymphocytes T. Ceci est plus apparent lors de l'évaluation de l'expression du marqueur d'activation précoce CD69 au sein de l'une ou l'autre des populations de lymphocytes T spécifiques à l'antigène. Une quantité accrue de signal CD69 (mesurée par l'intensité de fluorescence médiane, MFI) est présente lorsque les antigènes sont livrés combinés en un seul DA-SNA, la structure DA-SNA 2 surpassant tous les groupes testés (Fig. 1d). De plus, la délivrance d'antigènes dans les structures DA-SNA, quel que soit le placement de l'antigène, se traduit par une multiplication par deux de la prolifération des cellules T, une étape importante dans les réponses antitumorales, en utilisant des splénocytes OT1 spécifiques de l'antigène OVA1 (Fig. 1e).

Sur la base de ces découvertes in vitro prometteuses à l'aide de DA-SNA, nous avons évalué comment l'arrangement des antigènes délivrés affectait les réponses immunitaires in vivo. Des souris C57BL/6 ont été immunisées pour déterminer comment la formulation de l'antigène sur des nanostructures séparées ou identiques et comment le placement différent des antigènes restreints au MHC-I et restreints au MHC-II dans les vaccins DA-SNA affectent l'activation immunitaire. Les souris ont reçu trois injections au total (6 nmol d'ADN et chaque peptide; Fig. 2a et Extended Data Fig. 2). Au jour 35, les splénocytes ont été collectés pour évaluer les réponses immunitaires spécifiques élevées envers les deux antigènes peptidiques. Après la période de 5 semaines, les taux de CD8 + étaient significativement élevés pour l'immunisation au DA-SNA 2, atteignant environ 35% de la population de la rate par rapport au cas où un simple mélange contenant à la fois des antigènes peptidiques et de l'ADN adjuvant (appelé «mélange»), DA-SNA 1 et les équivalents séparés des deux DA-SNA ont été utilisés (Fig. 2b). Les niveaux de CD4 + n'ont été modifiés de manière significative que lorsque les souris ont été traitées avec l'équivalent séparé de DA-SNA 1. D'autres groupes de traitement ont diminué le niveau de lymphocytes T spléniques CD4 +, le groupe DA-SNA 2 étant le plus bas avec environ 11, 4% de la population de cellules spléniques (Fig. 2b). DA-SNA 2 a le plus augmenté de manière significative la production d'une cytokine pro-inflammatoire clé, IFN-γ, ainsi que d'un marqueur de dégranulation, CD107a, lors de la restimulation avec le peptide OVA1 ex vivo. L'immunisation DA-SNA 2 a également généré le plus grand pourcentage de lymphocytes T CD8 + spléniques polyfonctionnels (~ 15%, Fig. 2c, la stratégie de déclenchement peut être trouvée dans la Fig. 9 supplémentaire). De plus, cela était corrélé à une augmentation du pourcentage de cellules T CD8 + mémoire effectrices (CD44 + CD62L−, ~ 54%) (Fig. 2d, à gauche). Les niveaux de marqueurs pro-inflammatoires produits dans les cellules T CD8 + et la polyfonctionnalité de la population étaient significativement élevés pour la structure combinée DA-SNA 2 par rapport à son homologue séparé (Fig. 2c). La stimulation ex vivo des lymphocytes T CD4 + avec le peptide OVA2 a montré une augmentation globale de ces mêmes paramètres pour les DA-SNA et les formulations séparées par rapport au traitement par mélange, démontrant davantage l'importance de l'administration combinée d'antigène et d'adjuvant à une cellule immunitaire. Aucune différence significative n'a été observée entre la structure DA-SNA 1 et son équivalent séparé. Ces deux constructions ont induit les niveaux les plus élevés de ces marqueurs pro-inflammatoires dans les cellules T CD4 +, bien qu'une diminution statistiquement significative n'ait pas été observée entre les deux DA-SNA (Fig. 2c). De plus, la plus grande élévation des cellules T CD8 + spécifiques à OVA1 a été observée pour DA-SNA 2, environ 3 fois plus élevée que son équivalent séparé (Fig. 2e). En fin de compte, la contribution de la livraison combinée des deux types d'antigènes dans les structures DA-SNA a conduit à une plus grande sécrétion d'IFN-γ, mesurée par un test de point absorbant immunitaire lié à une enzyme (ELISpot). Les niveaux de cellules formant des taches (SFC) lors de la stimulation ex vivo avec l'antigène OVA1 restreint au MHC-I étaient les plus élevés avec le DA-SNA 2, et le DA-SNA 2 a généré des SFC 2, 3 fois plus élevés que son homologue séparé lors de la stimulation ex vivo de l'antigène MHC-I ou MHC-II (OVA2) (Fig. 2f). Une élévation des SFC a été observée pour les deux structures DA-SNA par rapport au mélange ; la plus grande amélioration globale a été observée pour le DA-SNA 2. Les splénocytes élevés par l'immunisation au DA-SNA 2 ont entraîné environ 2, 2 fois et environ 1, 7 fois plus de SFC que l'immunisation au DA-SNA 1 lorsqu'ils sont stimulés ex vivo avec OVA1 ou OVA2, respectivement, démontrant la puissance de cet arrangement d'antigènes sur un DA-SNA pour répondre ex vivo aux signaux antigéniques restreints au MHC-I ou restreints au MHC-II. L'administration d'antigènes encapsulés OVA1 et hybrides OVA2 a montré des différences entre les formulations séparées et combinées, avec la structure combinée DA-SNA 1 élevant les SFC dans une plus grande mesure lors de la stimulation OVA1 ex vivo, et la formulation séparée élevant les SFC dans une plus grande mesure lors de la stimulation OVA2 ex vivo. Prenant toute cette étude de manière holistique et compte tenu du rôle des lymphocytes T CD8 + dans l'activité antitumorale et de l'importance d'activer efficacement les deux sous-ensembles de réponses des lymphocytes T, nous avons exploité l'administration combinée d'antigène dans les structures DA-SNA dans une expérimentation plus poussée. Dans l'ensemble, lors de l'évaluation des différences de réponses immunitaires entre les DA-SNA, les résultats mettent en évidence que le positionnement de l'antigène restreint au MHC-I dans l'architecture hybride optimise la présentation des DC pour les réponses des lymphocytes T CD8 +, tandis que l'encapsulation de l'antigène restreint au MHC-II dans le noyau induit des améliorations modestes de l'activité CD4 + tout en préservant la fonction cytotoxique.

a, Calendrier d'immunisation bimensuelle pour les souris C57BL/6. Divers groupes de traitement à l'étude. Dose : 6 nmol par antigène ; 6 nmol d'adjuvant. b, Modification des populations de lymphocytes T CD8+ (à gauche) ou CD4+ (à droite) dans la rate après le schéma de vaccination. c, La production intracellulaire de la cytokine pro-inflammatoire IFN-γ (à gauche) ou du marqueur de dégranulation CD107a (au milieu) a été évaluée lors d'une restimulation ex vivo avec un antigène peptidique. Les lymphocytes T polyfonctionnels (doublement positifs pour les deux marqueurs) ont été quantifiés (à droite) pour les lymphocytes T CD8+ (en haut) ou CD4+ (en bas). Le DA-SNA 2 a significativement augmenté la production de tous les marqueurs dans les lymphocytes T CD8+, alors que les différences étaient plus subtiles entre la production dans les lymphocytes T CD4+, les deux DA-SNA élevant de manière observable les niveaux au-dessus de ceux des souris immunisées avec un vaccin mixte. d, le phénotype de la mémoire effectrice, mesuré par les marqueurs CD44 + CD62L−, a été augmenté par DA-SNA 2 pour les lymphocytes T CD8 + (à gauche). La fonction effectrice CD4+ (à droite) était la plus élevée pour Separate 1 Encap. 2 Hyb. immunisation. e, Pourcentage de lymphocytes T CD8 + spécifiques à OVA1, mesuré par coloration avec un dimère spécifique de l'antigène. f, nombres représentatifs et images (à gauche) de lymphocytes T spléniques sécrétant de l'IFN-γ lors de différentes stimulations ex vivo avec les SFC totaux mesurés par le test ELISpot (à droite). Moyenne ± sem indiquée. n = 3 à 6 souris par groupe. La signification statistique entre les comparaisons pertinentes est indiquée. Pour tous les panels, la signification a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey (b,c,d,f) ou de Dunnett (e).

Pour évaluer les facteurs possibles à l'origine de ces différences d'activation in vivo, nous avons évalué la voie d'administration des structures lors de l'immunisation. Nous avons administré des DA-SNA par voie sous-cutanée avec des marqueurs fluorophores pour les deux antigènes peptidiques et évalué la biodistribution après 24 h (Fig. 10 supplémentaire). Aucune différence significative dans l'accumulation dans les organes entre les deux DA-SNA n'a été observée pour l'antigène hybride. L'antigène encapsulé était principalement concentré dans le ganglion lymphatique avec très peu de détection dans les autres organes principaux, et surtout, une augmentation significative de l'accumulation a été observée à la suite de l'immunisation au DA-SNA 2. Nous avons cherché à évaluer si le trafic des ganglions lymphatiques pouvait s'expliquer par une différence dans le taux de libération des antigènes des structures DA-SNA (Fig. 11 supplémentaire). Les profils de libération réalisés dans des solutions physiologiquement pertinentes (10 % de FBS) ex cellulo ont montré des niveaux de libération relativement faibles pour l'antigène hybride dans les 48 h, alors que l'antigène encapsulé a atteint plus de 63 % de libération pour le DA-SNA 1 et un peu moins de 50 % pour le DA-SNA 2. Cependant, nous avons observé une absorption de SNA en aussi peu que 30 min25. Lorsque l'on regarde les profils de libération des DA-SNA au cours des premières heures d'exposition au sérum, les structures présentent les mêmes taux de libération, qui sont également <25% de l'antigène encapsulé total. La stabilité de l'enveloppe du liposome, et donc du SNA, s'est déjà avérée entraîner des différences de distribution29,36. Nous postulons que la stabilité des liposomes, influencée par la cargaison de peptides37,38, conduit aux différences observées dans la distribution des peptides encapsulés dans le DA-SNA. Néanmoins, nous soulignons que ce paramètre devrait être une considération de conception pour la sélection de la cargaison de peptides, qui varie en fonction de l'ensemble d'antigènes, et ce travail illustre d'importantes améliorations du vaccin basé sur la structure grâce à plusieurs ensembles d'antigènes différents. Nous concluons donc que les changements significatifs à l'échelle immunitaire observés in vivo ne peuvent pas être attribués uniquement aux différences de biodistribution ou de taux de libération d'antigènes entre les deux nanoparticules. De plus, lors de l'évaluation du trafic des antigènes dans les DC spléniques (Fig. 12 supplémentaire), aucune différence ne peut être résolue entre les deux DA-SNA, et surtout, les deux génèrent une importante population d'antigènes doublement positifs de DC par rapport aux souris naïves et aux souris administrées avec un simple mélange des composants. En raison de la variation minimale entre les DA-SNA en fonction de la distribution et du trafic au niveau des organes, nous avons effectué une analyse du transcriptome des cellules dendritiques pour évaluer l'impact du traitement avec les vaccins structurés différemment sur l'enrichissement des voies et l'expression globale des gènes (Fig. 13 supplémentaire et ensemble de données 1). Les structures DA-SNA affectent les voies des cellules dendritiques très différemment par rapport au traitement par mélange, où peu de voies significatives ont été enrichies. L'analyse de l'enrichissement des voies entre DA-SNA 1 et 2 suggère que DA-SNA 2 affecte l'internalisation et le traitement des voies des composants dans une plus grande mesure que DA-SNA 1.

Nous avons cherché à résoudre les voies de traitement de DA-SNA 1 et 2 dans les cellules dendritiques dans le but d'élucider cet impact sur la cinétique de signalisation. À l'aide de la microscopie confocale (Fig. 3), nous avons évalué le devenir intracellulaire des DA-SNA après leur absorption par les BMDC à des moments prédéterminés et comparé la co-localisation des antigènes hybrides et encapsulés avec des marqueurs organites pour l'endosome précoce (antigène endosomique précoce 1, EEA1), l'endosome tardif (Rab7), le lysosome (protéine membranaire associée au lysosomal 1, Lamp1), le réticulum endoplasmique (protéine disulf ide isomérase, PDI), MHC-I et MHC-II. Les données mettent en évidence qu'un traitement substantiel se produit à des moments antérieurs (c'est-à-dire <1 h). Le traitement au sein de l'endosome précoce démontre une cinétique comparable entre les deux structures (Fig. 3a). Des différences significatives entre les deux structures apparaissent dans l'endosome tardif (Fig. 3b), où le traitement et le trafic sont améliorés pour les antigènes hybrides et encapsulés pour la structure DA-SNA 2 par rapport aux deux antigènes pour DA-SNA 1. L'évaluation du lysosome a révélé des différences clés ; il y a une diminution de la co-localisation de l'antigène hybride de DA-SNA 2 (restreint au MHC-I) et une augmentation de la co-localisation de l'antigène encapsulé du DA-SNA 2 (restreint au MHC-II) (Fig. 3c), ce qui suggère une optimisation de la charge du MHC-II pour le DA-SNA 2. certains à des moments précoces, mais cela s'atténue rapidement et aucune augmentation significative n'est observée plus tard dans l'étude. Cela suggère également que toutes les voies de traitement optimisées DA-SNA 1 sont plus transitoires, car une co-localisation accrue de l'antigène hybride DA-SNA 1 (restreint au CMH-II) avec le CMH-II n'est pas non plus observée. L'analyse du traitement au niveau du réticulum endoplasmique (RE) n'a montré aucune différence majeure entre le traitement DA-SNA pour les antigènes hybridés. Cela pourrait être attribué à une cinétique de présentation croisée plus rapide avec l'arrangement structurel DA-SNA 2 pour l'antigène hybride et donc à une capture moins efficace de ce processus (Fig. 3d). À l'inverse, une co-localisation réduite de l'antigène encapsulé ER et DA-SNA 2 (restreint au MHC-II), significative au point de temps de 1 h, pourrait être attribuable à une diminution du trafic de l'antigène encapsulé restreint au MHC-II pour DA-SNA 2 à l'ER. Il est important de noter que l'antigène hybride de DA-SNA 2 (restreint au CMH-I) présentait une co-localisation accrue avec le CMH-I à des moments précoces (dès 30 min), avec des augmentations significatives observées jusqu'à 1 h (Fig. 3e), se traduisant par une présentation de surface OVA1 accrue par DA-SNA 2 sur le CMH-I (Fig. 14 supplémentaire). Bien que non significatif, il y a une augmentation tendancielle de l'antigène encapsulé DA-SNA 2 (restreint au CMH-II) avec le CMH-II à des moments ultérieurs (Fig. 3f). Comme il existe une co-localisation significative de l'antigène encapsulé DA-SNA 2 (restreint au CMH-II) avec l'endosome et le lysosome tardifs, nous suggérons que le chargement du CMH-II par incubation du DA-SNA est un processus plus lent que le chargement du CMH-I. De plus, les différences entre les traitements DA-SNA ont généralement diminué de 6 h, ce qui suggère que les différences immunologiques observées sont principalement dues à la cinétique précoce et au traitement de ces structures par les DC.

Images représentatives au microscope confocal (en haut) de BMDC incubées pendant 30 min avec DA-SNA 1 (à gauche) ou DA-SNA 2 (à droite) contenant à la fois un antigène hybride marqué par Cy5 (rouge) et un antigène encapsulé marqué par FITC (vert). Le noyau a été coloré par DAPI (bleu) et les organites suivants ont été colorés : a, EEA1 (endosome précoce) ; b, Rab7 (endosome tardif); c, Lampe1 (lysosome) ; d, PDI (réticulum endoplasmique) ; e, CMH-I ; f, CMH-II. Tous les organites sont représentés en jaune. Les coefficients de chevauchement de Mander (en bas) représentant la fraction du signal Cy5 ou FITC co-localisé avec les organites respectifs à 0, 5, 1, 6 et 24 h sont indiqués. Barre d'échelle, 10 μm. g,i, co-localisation et h,j, analyse par cytométrie en flux du traitement du DA-SNA 1 et du DA-SNA 2 dans les BMDC après une impulsion de 1 h et après un traitement de 24 h avec de la chloroquine (g, h) et de la bréfeldine A (i, j). La co-localisation d'OVA1 avec MHC-I (g) et ER (i) est montrée. k,l, Co-localisation d'OVA2 avec le lysosome en présence de leupeptine (k) et de MHC-II en présence de chloroquine (l). Pour a–f, les données montrent la moyenne ± sd de 6 à 10 champs de vision sélectionnés au hasard. La signification statistique a été calculée à l'aide d'une ANOVA à deux voies avec le test de comparaisons multiples de Sidak. Pour g–l, les données montrent la moyenne ± sem pour n = 3–6 répétitions. La signification statistique a été calculée à l'aide d'un test t non apparié avec la correction de Welch (g,i,k,l) ​​et d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey (h,j).

Pour élucider davantage les voies impliquées dans la présentation de l'antigène DA-SNA 1 et 2, nous avons utilisé des inhibiteurs pour évaluer de manière mécaniste le traitement de l'antigène. L'ajout d'un perturbateur de l'acidification endosomale (chloroquine)39 dont il a été démontré qu'il augmentait l'étendue de la présentation croisée39,40 a un impact sur la co-localisation d'OVA1 avec les complexes MHC-I. Grâce à cette présentation croisée améliorée, nous observons que DA-SNA 2 induit une co-localisation accrue d'OVA1 avec MHC-1 (Fig. 3g). Ces données suggèrent que DA-SNA 2 peut tirer parti de la présentation croisée améliorée plus efficacement que DA-SNA 1. Cet avantage architectural se traduit finalement par une plus grande présentation de surface d'OVA1 sur MHC-I (Fig. 3h). L'ajout de Brefeldin A, qui inhibe le transport des complexes peptide-MHC-I assemblés du RE à la membrane cellulaire, et empêche ainsi la présentation croisée, a un impact plus négatif sur DA-SNA 2. Il y a une diminution significative (4,7 fois) de la co-localisation du peptide OVA1 avec le RE lors du traitement par Brefeldin A pour DA-SNA 2 (Fig. 3i), se traduisant par une perte complète de la présentation de surface OVA1 sur MHC-I (Fig. 3j). L'impact des inhibiteurs de la voie sur le traitement d'OVA2 a également été analysé. L'ajout de leupeptine, un inhibiteur des protéases à cystéine et à sérine (par exemple, les cathepsines B, S et L)42, entraîne une baisse de la co-localisation d'OVA2 avec le lysosome (le site de chargement du CMH-II) pour DA-SNA 2 (Fig. 3k). La présentation de l'antigène via DA-SNA 2 est donc plus négativement impactée dans le traitement du CMH-II lors de l'ajout d'inhibiteur. De plus, l'utilisation de la chloroquine, connue pour bloquer le traitement antigénique dépendant du MHC-II43,44,45, entrave la capacité d'OVA2 dans le DA-SNA 2 à se co-localiser avec le MHC-II (Fig. 3l). Le DA-SNA 2 est donc plus fortement impacté par l'ajout d'inhibiteurs qui perturbent le traitement des CMH-I et -II, indiquant ainsi que la présentation et les profils cinétiques fournis par le DA-SNA 2 sont mieux adaptés au traitement de l'antigène.

Pour comprendre comment les différents DA-SNA et les traitements par mélange induisaient des réponses aussi variées des cellules T en aval, nous avons collecté et isolé les cellules T CD8 + et CD4 + spléniques après immunisation en suivant le même schéma de la Fig. 2 et avons effectué un séquençage d'ARN en vrac (RNAseq). L'analyse en composantes principales (ACP) a révélé de manière holistique que les profils d'expression des gènes des cellules T CD8 + et CD4 + des souris immunisées avec des formulations de mélange étaient les plus similaires à ceux des souris naïves, ce qui suggère que c'est la cause de la faible activation globale (Fig. 4a). Les souris immunisées avec DA-SNA 2 étaient les plus distinctes des souris naïves dans leur transcriptome CD8 +, alors que les DA-SNA 1 et 2 différaient des souris naïves dans leurs profils d'expression génique dans les cellules T CD4 + d'une manière similaire. Cela suggère une justification des augmentations significatives de la fonction des cellules T CD8 + induites par DA-SNA 2, mais des niveaux similaires de fonction des cellules T CD4 + entre les deux DA-SNA observés à la Fig. 2. SNA 1 (figure 4b). Les gènes régulés de manière différentielle ont été enrichis dans des voies impliquant des réponses inflammatoires et une régulation positive des cytokines pro-inflammatoires, la chimiotaxie et la migration de populations clés de cellules immunitaires (Fig. 4c et ensemble de données supplémentaire 2). Alors que certaines des voies enrichies du traitement DA-SNA 2 étaient partagées avec le traitement par mélange et d'autres avec le traitement DA-SNA 1, dans l'ensemble, l'activation généralisée induite au niveau du transcriptome pour l'architecture DA-SNA 2 était corrélée à des sorties immunologiques améliorées.

a, tracé PCA du transcriptome complet des lymphocytes T CD8+ (à gauche) et CD4+ (à droite). b, Modifications de l'expression génique représentées par des sous-ensembles de LFC pour les populations de lymphocytes T CD8 + (à gauche) et CD4 + (à droite) à la suite de différents traitements. c, Sélection de voies significativement enrichies calculées à l'aide de l'analyse GSEA. Les couleurs des carrés correspondent au score d'enrichissement pour chaque voie à la suite de différents traitements pour les cellules T CD8 + (à gauche) et CD4 + (à droite). d, signatures génétiques pour les lymphocytes T CD8+ (en haut) et CD4+ (en bas). Les couleurs font référence aux niveaux d'expression génique normalisés (z-scorés). Sélection de gènes pertinents étiquetés. e, parcelles Volcano des cellules T CD8 + (à gauche) et CD4 + (à droite) entre une comparaison par paires de DA-SNA 2 et DA-SNA 1. Les points colorés indiquent des gènes exprimés de manière significative; un LFC positif indique une régulation à la hausse pour DA-SNA 2 par rapport à DA-SNA 1 (rouge) tandis qu'un LFC négatif indique une régulation à la baisse pour DA-SNA 2 par rapport à DA-SNA 1 (bleu).

Des signatures génétiques pertinentes ont été identifiées pour l'activation et le fonctionnement immunitaires adaptatifs et innés dans tous les traitements et comprennent, par exemple, CXCR3, TNFSF9 et GZMK (Fig. 4d et ensemble de données supplémentaire 3). Ces gènes ont une importance particulière dans la fonction effectrice et le trafic des lymphocytes T, la présentation de l'antigène et la génération de lymphocytes T cytotoxiques, et la fonction cytolytique des lymphocytes T auxiliaires, respectivement. Une comparaison particulière de DA-SNA 2 par rapport à DA-SNA 1 démontre des différences génétiques uniques induites à l'échelle nanométrique simplement en modifiant le placement de la classe d'antigène (Fig. 4e). Un total de 452 et 229 gènes significatifs se chevauchant dans les lymphocytes T CD8+ et CD4+, respectivement, ont été détectés entre les deux DA-SNA. Plus précisément, DA-SNA 2 a induit une expression plus élevée de IL2RA, CD44 et XCL1 dans les lymphocytes T CD8+ et LAG3, CCR7 et CCL9 dans les lymphocytes T CD4+ par rapport à DA-SNA 1. En fin de compte, la comparaison des signatures génétiques dans tous les traitements de vaccination met en évidence l'impact substantiel que la structure du vaccin et en particulier le placement de l'antigène à l'échelle nanométrique ont sur le génome et les modèles d'expression. Ces résultats soulignent les mesures immunologiques qui ont été détectées, fournissant une justification mécaniste qui a mis en évidence les voies menant à l'activation des lymphocytes T et aux réponses durables, et détaillent un cadre pour la conception de vaccins en utilisant des considérations de structure utiles.

Pour évaluer l'efficacité thérapeutique et l'impact immunologique des DA-SNA, nous avons utilisé un modèle murin de cancer du lymphome E.G7-OVA en raison de son expression stable de la protéine OVA, exprimant à la fois les épitopes OVA1 et OVA2 utilisés ci-dessus46. En bref, des souris C57BL / 6 ont été inoculées par voie sous-cutanée avec des cellules E.G7-OVA et immunisées chaque semaine avec du DA-SNA ou des formulations mélangées (6 nmol de chaque antigène OVA1 et OVA2, 6 nmol d'ADN adjuvant) (Fig. 5a). Les souris porteuses de tumeurs immunisées avec DA-SNA 2 ont démontré une réduction d'environ 3 fois de la croissance tumorale par rapport aux groupes témoins (traités avec une solution saline) et mélangés dès 5 jours après la deuxième immunisation (jour 15) et plus de 16 fois plus de différence dans la croissance tumorale par rapport aux souris traitées avec une solution saline 22 jours après l'inoculation de la tumeur (Fig. 5b et Supplémentaire Fig. 15). Il est important de noter que le traitement au DA-SNA 1 n'a pas stoppé efficacement la croissance tumorale par rapport au mélange, contrairement au traitement au DA-SNA 2. Comparé au mélange et au DA-SNA 1, le DA-SNA 2 a produit une réduction d'environ 7 fois de la croissance tumorale au jour 24, soulignant l'impact prononcé du positionnement de l'antigène et, finalement, se traduisant par une extension significative de la survie des animaux (survie médiane en jours : PBS = 27 ; Admix = 24 ; DA-SNA 1 = 28 ; DA-SNA 2 = 35) (Fig. 5c). Pour étudier plus en détail l'impact physique du traitement sur la croissance tumorale, les tumeurs ont été excisées des souris au jour 15 suivant le même schéma thérapeutique, puis pesées (Fig. 5d et Supplémentaire Fig. 16). Fait intéressant, à ce stade de la courbe de croissance tumorale, les deux groupes SNA ont présenté une réduction significative du poids des tumeurs par rapport aux souris traitées au PBS, ce qui suggère que le DA-SNA 1 est capable de déclencher une réponse immunitaire antitumorale, mais cette réponse n'est pas aussi durable que celle suscitée par le DA-SNA 2.

a–c, des souris C57BL/6 ont été inoculées par voie sous-cutanée (a) avec des cellules E.G7-OVA (5 × 105) dans le flanc droit et ont reçu des immunisations hebdomadaires à partir du jour 3 pour un total de quatre vaccinations (6 nmol d'adjuvant, 6 nmol de chaque antigène). Les courbes de croissance moyenne (b) et de survie des animaux (c) sont présentées. Valeurs P indiquées pour le volume au jour 24 de DA-SNA 2 par rapport à DA-SNA 1 et Admix (b). Les données montrent la moyenne ± sem de deux expériences indépendantes avec n = 7–9. d, poids suivant le programme de traitement décrit en a (au jour 15). e, Gauche : évaluation des lymphocytes T CD8+ immunitaires dans la rate à la fin de l'expérience. A droite : rapport des lymphocytes T CD8+/CD4+. f – i, analyse par cytométrie en flux au jour 15 des PBMC isolées de souris porteuses de tumeurs selon le schéma décrit en a. f, cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène OVA1. g, lymphocytes T CD8 + à mémoire effectrice (CD44 + / CD62L-) dans ce sous-ensemble de lymphocytes T spécifiques à l'antigène. h, cellules T CD4+ spécifiques de l'antigène OVA2. i, lymphocytes T CD4+ à mémoire effectrice (CD44+/CD62L−). Les données montrent la moyenne ± sem avec n = 4 à 6 souris par groupe. Pour b, d–g et i, la signification a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey. Le panel h a utilisé une ANOVA de Welch suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett en raison des différences significatives de sd entre les groupes. Le panel c a été analysé à l'aide d'un test du log-rank.

Données source

Les différences immunologiques résultant de l'administration de plusieurs antigènes ont été élucidées en collectant des rates de souris porteuses de tumeur E.G7-OVA et en évaluant les modifications des cellules T CD8 + et CD4 + spléniques (Fig. 5e). La rate des souris traitées au DA-SNA 2 a généré un pourcentage significativement plus élevé de lymphocytes T CD8+ par rapport aux autres groupes de traitement et a également affiché un rapport global plus élevé de lymphocytes T CD8+ sur CD4+. Pour évaluer les différences immunologiques qui ont contribué à la suppression tumorale, des souris C57BL/6 porteuses de tumeurs ont été évaluées pour les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) circulantes au jour 15, lorsque des différences de croissance tumorale ont été observées pour la première fois et lorsque l'impact du traitement DA-SNA 2 a commencé à stopper la croissance tumorale tandis que les autres traitements avaient un impact négligeable. Notamment, les souris traitées au DA-SNA 2 présentaient le plus haut niveau de lymphocytes T CD8 + spécifiques à l'antigène circulant (Fig. 5f, stratégie de déclenchement dans la Fig. 17 supplémentaire). Ce sous-ensemble de lymphocytes CD8+ a ensuite été évalué pour leur phénotype mémoire. Dans ce cas, le traitement au DA-SNA 2 a significativement élevé le phénotype de la mémoire effectrice à plus de 60 % des lymphocytes T CD8+ circulants spécifiques à OVA1 (Fig. 5g). Les cellules T CD4 + spécifiques de l'antigène étaient également significativement élevées chez les souris traitées avec les DA-SNA (Fig. 5h). Comme prévu, en raison des profils de transcriptome et des paramètres immunologiques précédemment explorés ici pour les lymphocytes T CD4 +, il y avait des différences négligeables entre les deux groupes DA-SNA. Bien qu'il n'y ait pas suffisamment de lymphocytes T CD4 + spécifiques à OVA2 pour délimiter avec précision le phénotype mémoire au sein de cette sous-population, l'intégralité des lymphocytes T CD4 + a démontré un état de mémoire effecteur amélioré lorsqu'il était traité avec DA-SNA 1 (~ 30% des cellules T CD4 +) par rapport au traitement avec DA-SNA 2, qui a mûri ~ 10% des cellules T CD4 + (Fig. 5i).

Pour déterminer la polyvalence et la traduisibilité des règles de conception pour guider le placement structurel pour la vaccination multi-antigène, nous avons utilisé le modèle de carcinome du côlon MC-38 connu pour sa charge mutationnelle élevée47. En bref, des souris C57BL/6 ont été inoculées par voie sous-cutanée avec des cellules MC-38 et immunisées chaque semaine avec des DA-SNA contenant des néo-antigènes MHC-I 'Adpgk I'14 et 'Adpgk II', un antigène censé se lier efficacement au MHC-II (https://www.iedb.org et réf. 48,49,50) (6 nmol chacun d'antigène Adpgk I et Adpgk II, 6 nmol d'ADN adjuvant) (Données étendues Fig. 3a – c). La croissance tumorale a été inhibée de manière similaire pour les souris immunisées avec DA-SNA 2, avec une prolongation significative de la survie conférée à ces animaux (survie médiane en jours : PBS = 27 ; DA-SNA 2 = 38). Ces différences résultent probablement d'une combinaison d'augmentations significatives du microenvironnement tumoral et du nombre élevé de cellules immunitaires circulantes. Les cellules T CD8 + et CD4 + ont augmenté dans le microenvironnement tumoral (Données étendues Fig. 3d, e, stratégie de déclenchement dans la Fig. 18 supplémentaire) et une réduction significative des cellules suppressives dérivées de la myéloïde Gr-1 + CD11b + a été observée (Données étendues Fig. 3f). De plus, le traitement au DA-SNA 2 a augmenté le pourcentage de lymphocytes T CD8 + spécifiques d'Adpgk I et induit une immunité adaptative des lymphocytes T spléniques. Lors de la stimulation ex vivo d'Adpgk I et II, les splénocytes traités au DA-SNA 2 ont sécrété plus d'interféron gamma que les splénocytes traités au DA-SNA 1 ou au PBS (données étendues Fig. 3g, h).

Les résultats obtenus concernant la structure du DA-SNA jusqu'à présent ont été utilisés pour évaluer la capacité du placement à double antigène à avoir un impact sur la croissance des tumeurs de mélanome B16-F10. Ce modèle a été établi comme très agressif avec des propriétés immunosuppressives renforcées51. Les néo-épitopes M27 et M30 récemment rapportés52 contenant des mutations présentes uniquement dans la tumeur ont été sélectionnés comme antigènes MHC-I et MHC-II, respectivement. Initialement, les souris C57BL / 6 inoculées avec des cellules tumorales B16-F10 et recevant une vaccination hebdomadaire 3 jours après l'inoculation tumorale de DA-SNA 1 ou DA-SNA 2 ont présenté une inhibition de la croissance tumorale au jour 17 par rapport aux souris traitées avec une solution saline (68% et 48%, respectivement) (Fig. 6a, b). En effet, une augmentation statistiquement significative d'environ 4 fois des lymphocytes T CD8 + spécifiques à l'antigène mémoire effecteur circulant a été observée chez les souris traitées avec les deux DA-SNA par rapport au traitement salin (Fig. 6c, stratégie de déclenchement dans la Fig. 17 supplémentaire). Par conséquent, une réponse immunitaire spécifique à l'antigène est produite, mais l'impact négligeable que cela a sur la croissance tumorale indique la probabilité d'un environnement tumoral hautement immunosuppresseur qui inhibe le potentiel thérapeutique de ces lymphocytes T.

a, b, des souris C57BL/6 ont été inoculées par voie sous-cutanée (a, en haut) avec des cellules B16-F10 (105) dans le flanc droit et ont reçu des immunisations sous-cutanées hebdomadaires à partir du jour 3 pour un total de quatre vaccinations (9 nmol d'adjuvant, 9 nmol de chaque antigène). Les courbes de croissance moyenne (a, en bas) et la survie des animaux (b) sont présentées. c, lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène M27 et marqueurs de lymphocytes T CD8+ mémoire 44+/62− dans des PBMC isolés. Les données montrent la moyenne ± sem de deux expériences indépendantes avec n = 6–7. d, e, souris porteuses de tumeur B16-F10 recevant des immunisations sous-cutanées hebdomadaires de DA-SNA combinés à un inhibiteur de point de contrôle immunitaire anti-PD-1 administré par voie intrapéritonéale à 3 et 6 jours après l'immunisation par DA-SNA. Les courbes de croissance moyenne (d) et de survie des animaux (e) sont présentées. Valeurs P indiquées pour la croissance comparant anti-PD-1 à DA-SNA 2 + anti-PD-1 aux jours 17, 20 et 22. Les données montrent la moyenne ± sem de deux expériences indépendantes avec n = 9–15. f – k, analyse par cytométrie en flux au jour 17 des PBMC isolées de souris porteuses de tumeur recevant le calendrier indiqué en d. f, évaluation des lymphocytes T CD8+ circulants. g, Cellules T CD8+ à mémoire effectrice totale (CD44+/62L−). h, lymphocytes T CD8+/CD19− spécifiques de M27. i, Quantification des lymphocytes T CD4+ circulants. j, Évaluation des lymphocytes T CD4+ à mémoire effectrice (CD44+/62L−). k, lymphocytes T CD4+/CD19− spécifiques de M30. Les données montrent la moyenne ± sem de n = 5 à 6 souris par groupe. Pour tous les panels sauf b et e, la signification a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey. La survie des animaux (b, e) a été analysée à l'aide d'un test du log-rank. Les hashtags en d indiquent des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement DA-SNA 2 + anti-PD-1 et anti-PD-1. ND, non détecté.

Données source

En raison de ces observations et de l'agressivité inhérente de ce modèle de tumeur, les traitements DA-SNA ont été associés à l'inhibiteur de point de contrôle immunitaire anti-PD-1, un traitement approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour le mélanome avancé, dans le but de surmonter l'immunosuppression de la tumeur53,54. Ces traitements ont débuté 3 jours après l'inoculation de la tumeur B16-F10. Notamment, lorsque l'anti-PD-1 a été co-administré avec des DA-SNA, une diminution significative de la croissance tumorale a été observée dès 17 jours après l'inoculation de la tumeur chez les animaux traités avec la thérapie combinée DA-SNA 2 + anti-PD-1, alors qu'aucune diminution substantielle de la croissance tumorale n'a été observée chez les souris des autres groupes de traitement (Fig. 6d et Supplémentaire Fig. 19). Cela s'est traduit par une prolongation de 40 % de la survie médiane de ces souris par rapport à celles des groupes traités avec une solution saline ou traités en monothérapie anti-PD-1 (Fig. 6e). L'importance et le rôle que joue le placement d'antigène à l'échelle nanométrique dans la conduite de réponses immunitaires synergiques et améliorées peuvent être tirés de ces résultats. Il est important de noter qu'une comparaison entre les groupes de traitement combiné DA-SNA a révélé une amélioration de la survie médiane globale pour les animaux combinés DA-SNA 2 + anti-PD-1 (P = 0,0507). L'évaluation des cellules immunitaires isolées du sang périphérique met davantage en évidence cette différence induite par la structure où le DA-SNA 2 semble fonctionner en synergie avec l'inhibiteur de point de contrôle. Une augmentation significative des lymphocytes T CD8 + circulants chez les animaux recevant un traitement combiné DA-SNA 2 + anti-PD-1 a été observée par rapport à tous les autres groupes (Fig. 6f). Fait intéressant, lorsque la population totale de lymphocytes T mémoire effectrice CD8 + a été évaluée parmi ces PBMC en circulation, des augmentations significatives ont été détectées pour les deux groupes combinés DA-SNA + anti-PD-1, avec DA-SNA 2 + anti-PD-1 générant des phénotypes de mémoire effectrice dans ~ 60% des cellules T CD8 + en circulation (Fig. 6g). De plus, seule cette combinaison de traitement DA-SNA 2 + anti-PD-1 a pu induire une réponse robuste des lymphocytes T CD8 + spécifiques de l'antigène (Fig. 6h). Les observations de la circulation des lymphocytes T CD4 + ont révélé une augmentation similaire à la suite de la thérapie combinée DA-SNA 2 + anti-PD-1 (Fig. 6i), bien que les deux groupes combinés DA-SNA + anti-PD-1 aient significativement élevé le phénotype de la mémoire effectrice à environ 28% de la population de cellules T CD4 + (Fig. 6j). Le traitement combiné DA-SNA 2 + anti-PD-1 a augmenté les niveaux de production de lymphocytes T CD4 + spécifiques de l'antigène avec la monothérapie anti-PD-1 par rapport au traitement DA-SNA 1 + anti-PD-1, bien que des différences significatives n'aient pas été observées entre les groupes (Fig. 6k).

Bien que des recherches approfondies aient exploré l'importance des adjuvants et des antigènes dans la création de nouvelles immunothérapies, jusqu'à présent, l'importance de la présentation structurelle de plusieurs antigènes dans une construction spécifique et son rôle dans l'obtention d'une réponse immunitaire puissante et souhaitée n'ont pas été explorées. Dans ce travail, nous avons montré que, pour l'efficacité du vaccin, le placement de l'antigène peut être aussi critique que le choix de l'antigène. En effet, lors de la modification du placement des antigènes restreints au MHC-I et restreints au MHC-II dans deux vaccins presque identiques sur le plan de la composition, le bénéfice du traitement contre les tumeurs est considérablement modifié ; un vaccin est puissant et l'autre est inefficace. Les origines de ces différences peuvent être dues au positionnement de l'antigène affectant la voie de traitement qu'il subit dans une cellule immunitaire, ainsi que son temps de séjour dans différents compartiments cellulaires. En modifiant la voie de traitement et ces cinétiques de signalisation, cela affecte la réponse immunitaire qui en résulte aux niveaux génétique, cellulaire et de l'organisme. Un CMH-II encapsulé et un antigène hybride restreint au CMH-I régulent à la hausse des gènes spécifiques des réponses inflammatoires, de la chimiotaxie et de la migration des cellules immunitaires clés, qui ensemble influencent l'activité des cellules immunitaires. Ces différences génétiques structurellement définies se traduisent par un comportement immunologique lors d'une immunisation in vivo répétée et définissent finalement les profils de croissance tumorale dans plusieurs modèles de tumeurs, y compris le lymphome E.G7-OVA et le carcinome du côlon MC-38 cliniquement pertinent et les systèmes tumoraux de souris mélanome B16-F10. Il s'agit d'une démonstration clé de l'impact du positionnement de l'antigène vaccinal sur plusieurs processus cellulaires.

Le développement de vaccins s'est concentré sur la composition, le nombre et le type d'antigène, et le rapport de ces composants, sans prêter attention à leur présentation structurelle. Il est clair qu'en plus de ces paramètres importants, la présentation de l'antigène doit être au centre du développement futur d'un vaccin. Avoir le pouvoir d'optimiser la présentation de l'antigène pour correspondre à un profil de signalisation souhaité est essentiel pour générer de futurs vaccins puissants, où de petits changements de vaccin dans le placement de l'antigène augmentent considérablement la communication cellule-cellule, la diaphonie et la synergie cellulaire. Cette information peut être exploitée pour les cibles encore à découvrir, ainsi que pour celles déjà utilisées. Pris ensemble, les développements réalisés dans ce travail ouvrent la voie pour repenser la conception de vaccins contre le cancer et d'autres maladies.

Sauf indication contraire, tous les réactifs ont été achetés dans le commerce et utilisés tels qu'ils ont été reçus. Les oligonucléotides ont été synthétisés comme décrit ci-dessous. Les peptides ont été achetés auprès de Genscript ou du noyau de synthèse de peptides de Northwestern. Les produits chimiques ont été achetés auprès de fournisseurs énumérés entre parenthèses. Des souris C57BL/6 et des souris femelles C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT1, 003831) âgées de 8 à 12 semaines ont été achetées auprès de Jackson Laboratory. Les souris ont été utilisées conformément à toutes les directives et réglementations nationales et locales, et les protocoles exécutés ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Northwestern. Les cellules E.G7-OVA et B16-F10 ont été achetées auprès de l'ATCC. Les cellules MC-38 ont été gracieusement fournies par le Dr Bin Zhang. Les anticorps ont été achetés et les clones sont fournis dans le tableau supplémentaire 3.

Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur ABI 394 en utilisant la chimie standard des phosphoramidites avec des squelettes phosphate ou phosphorothioate comme indiqué (tableau supplémentaire 1). Après la synthèse, les brins ont été déprotégés à l'aide d'une solution 1: 1 d'hydroxyde d'ammonium à 37% / méthylamine à 40% à 55 ° C pendant 35 min, à moins qu'ils ne contiennent un colorant, auquel cas ils ont été déprotégés à l'aide d'hydroxyde d'ammonium à 37% à température ambiante (rt) pendant la nuit. Les brins ont ensuite été purifiés à l'aide d'une colonne C18 ou C4 (pour les brins contenant du colorant ou du cholestérol) sur HPLC en phase inverse, et les pics ont été collectés sous forme de fractions. Le groupe diméthoxytrityle (DMT) a été retiré des brins de produit par incubation dans de l'acide acétique aqueux à 20 % à température ambiante pendant 1 h, suivi de trois lavages avec de l'acétate d'éthyle pour éliminer le DMT. Le produit final a été lyophilisé et remis en suspension dans de l'eau déminéralisée (diH2O). La concentration a été mesurée en utilisant l'absorption UV-vis à 260 nm, avec des coefficients d'extinction calculés via l'outil en ligne IDT OligoAnalyzer (énuméré dans le tableau supplémentaire 1).

Les oligonucléotides fonctionnalisés au thiol dans diH2O ont été réduits pour générer un thiol libre pour les réactions futures. La réduction a été effectuée en utilisant du dithiothréitol (100 mM, DTT, Sigma) dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 8,5 à une concentration finale de 100 mM à ta pendant 45 min. Cette solution a été lavée dans un filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 3 kDa (Amicon) au moins 3 fois avec du diH2O. Pour les conjugués peptidiques OVA, le peptide a été acheté sur résine et lavé trois fois chacun avec du diméthylformamide (DMF) et de l'acétone avant de faire réagir 5 µmol à température ambiante pendant une nuit avec une solution de carbonate de succinimidyl 2-(2-pyridyldithio)éthyle (SDEC, fabriqué en utilisant les protocoles précédents55) dissous dans du DMF (10 équivalents par rapport à la charge initiale de peptide sur le support solide), avec de la N,N-diisopropyléthylamine (5 équivalents). Les billes ont ensuite été lavées trois fois avec du DMF puis de l'acétone, et séchées à l'air avant d'être déprotégées avec de l'acide trifluoroacétique à 95 % (2,5 % de triisopropylsilane, 2,5 % de diH2O) pendant 1 h à température ambiante. L'acide trifluoroacétique a été soufflé à l'aide d'azote, et les billes ont été redissoutes dans du DMF et filtrées sur de la laine de verre. Le produit peptidique a été précipité en ajoutant environ 5 à 6 fois de l'éther diéthylique et a été laissé à -20 ° C pendant 1 à 2 h pour précipiter davantage. La solution a été centrifugée (2 000 × g, 3 min) pour sédimenter le peptide, qui a été recueilli, séché et dissous dans du DMF. L'ADN réduit (0, 5 µmol) a été mis à réagir pendant une nuit à température ambiante avec le peptide dissous (5 µmol) dans du DMF à 70–75% dans de l'eau pour un volume de réaction total d'environ 1, 5 ml. Pour les conjugués peptidiques, les peptides ont été activés en utilisant de la 2,2'-dithiodipyridine (150 µmol) dissoute dans 10 équivalents de DMF sous agitation douce pendant 30 min à température ambiante. Le peptide activé a ensuite été lavé 3 fois dans de l'éther diéthylique, culotté par centrifugation (2 000 x g, 3 min) et laissé sécher. L'ADN réduit (0,3 µmol) a été mis à réagir pendant une nuit à température ambiante avec le peptide dissous (1,5 µmol) dans ~ 70 % de DMF dans de l'eau pour un volume de réaction total de ~ 1,5 ml.

Après la conjugaison du peptide, les solutions ont été centrifugées à 17 000 × g pendant 2 min pour sédimenter tout peptide précipité, et le surnageant a été transféré sur des filtres centrifuges MWCO de 3 kDa pendant 3 à 4 lavages avec du diH2O. Le volume a été concentré à <500 μl et les solutions ont été purifiées par dénaturation à l'échelle préparatoire (urée 8 M) de gels PAGE à 15% (pas plus de 0, 5 μmol d'ADN chargé sur un seul gel). Les gels ont été exécutés pendant 30 min à 175 V, puis environ 3 h à 350 V, puis imagés à l'aide d'une lampe UV pour découper les bandes souhaitées. Les bandes de gel découpées ont été écrasées et le produit a été collecté par trois lavages avec un tampon Tris/Borate/EDTA 1x toutes les ~ 4 h. La masse du produit a été confirmée par spectrométrie de masse à ionisation électrospray (ESI-MS) et les concentrations ont été mesurées par UV-vis à 260 nm en supposant un coefficient d'extinction de l'ADN.

Les SNA ont été synthétisés comme indiqué précédemment avec de légères modifications16,56. En bref, des films lipidiques séchés de 50 mg de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC, Avanti Polar Lipids) ont été hydratés avec 3 à 4 ml de PBS ou de peptide contenant du PBS pour les liposomes encapsulés. (Remarque : solutions contenant le peptide inclus OVA1 : 1 mg ml-1 dissous dans du PBS contenant ~100 µl de NaOH 1 M ; OVA2 : 1 mg ml-1 dissous dans du PBS contenant ~60 µl de NaOH 1 M ; M27 : 2,25 mg ml-1 dissous dans du PBS contenant ~60 µl de NaOH 1 M ; M30 : 1 mg ml-1 dissous dans du PBS contenant ~100 µl de NaOH 1 M ; AgdpkI : 1 mg/ml dissous dans du PBS contenant 120 μl de NaOH 1M ; Agdpk II : 0,65 mg/ml dissous dans du PBS contenant 50 μl de NaOH 1M.) Les solutions ont été soumises à 20 congélations-décongélation dans de l'azote liquide puis sonication à 37–40 °C. Les liposomes ont été extrudés par extrusion séquentielle à haute pression (Northern Lipids) en utilisant des filtres en polycarbonate avec des tailles de pores de 200, 100, 80 et 50 nm ; les liposomes ont été passés à travers chaque taille de pore 3 fois. Après l'extrusion, les liposomes ont été concentrés jusqu'à environ 2 à 3 ml à l'aide de filtres centrifuges MWCO de 100 kDa et dialysés pendant une nuit contre 3, 5 l de PBS pour éliminer le peptide non encapsulé. La concentration en liposomes a été déterminée à l'aide d'un kit de dosage de phosphatidylcholine (Sigma, MAK049-1KT), en supposant qu'un liposome de 50 nm contient 18 140 lipides par liposome24. La concentration en peptide, si les liposomes encapsulaient le peptide, a été déterminée à l'aide d'un kit de test de fluorescence Pierce (ThermoFisher, 23290) en ajoutant 1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) pour rompre les liposomes et libérer le peptide pour la quantification, et en utilisant le peptide dissous dans 1 % de SDS comme courbe standard. La charge de peptide par liposome a été calculée en divisant la concentration de peptide par la concentration de liposome. Les quantités de chaque antigène par particule variaient d'environ 25 à 40 selon le rendement d'encapsulation de chaque lot, qui a été ajusté en utilisant différentes concentrations de départ.

Des conjugués oligonucléotide-peptide purifiés ont été mélangés dans un rapport molaire de 1: 1 avec de l'ADN CpG complémentaire à terminaison 3'-cholestérol et centrifugés pendant une nuit. Le lendemain, environ 20 à 40 μl de tampon duplex (IDT) ont été ajoutés et la solution a été lentement refroidie pour duplexer les brins en suivant le programme : 70 ° C pendant 10 min, 23 ° C pendant 1,5 h, 4 ° C pendant ≥ 1 h. Le duplex a été ajouté à une solution de liposomes synthétisés en une quantité équimolaire au peptide encapsulé dans le liposome. Pour obtenir le maximum de 75 brins par liposome, l'espace restant a été rempli avec de l'ADN T20 à terminaison 3'-cholestérol. Ce mélange a été incubé à 37°C pendant une nuit puis stocké à 4°C.

Des DA-SNA contenant des antigènes marqués au fluorophore (2 μM dans un volume de 1,5 ml) ont été placés dans un dispositif de dialyse Slide-A-Lyzer MINI dans des tubes Falcon de 50 ml avec un MWCO de 10K. La solution de tube Falcon a été préparée pour être 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) dans du PBS. Les échantillons ont été chargés et laissés sur un rotateur, et à des moments précis, 200 μl d'échantillon ont été prélevés et congelés à -20 ° C jusqu'à l'analyse à l'aide d'un lecteur de plaques BioTek.

Toutes les cellules ont été maintenues à 37°C dans un incubateur à 5% de CO2. E.G7-OVA, MC-38 et les DC ont été cultivées avec du milieu RPMI 1640 (Gibco, 11875093) contenant 10 % de FBS inactivé par la chaleur (HI) et 1 % de pénicilline-streptomycine, appelée ici RPMI+/+. B16-F10 ont été manipulés à l'aide de milieux DMEM (Gibco, 11965092) contenant 10 % de HI-FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.

Des cellules de moelle osseuse ont été prélevées sur des souris selon un protocole antérieur55. En bref, les globules rouges ont été lysés avec 2 à 3 ml de tampon de lyse ACK (Gibco, A1049201) pendant environ 4 min et étalés sur des boîtes de culture cellulaire de 10 cm2 avec 40 ng ml-1 facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (BioLegend, 576304) pendant 5 à 7 jours avant utilisation pour différencier les DC de la population.

Les cellules ont été collectées à partir de boîtes de culture cellulaire de 10 cm2 et les DC ont été isolées du mélange à l'aide d'un kit de sélection positive à la biotine magnétique (Stemcell Technologies, 17665). Un anticorps CD11c+ marqué à la biotine a été utilisé pour sélectionner les DC (BioLegend) et, après séparation, les DC purifiées ont été comptées à l'aide d'un analyseur de viabilité cellulaire Vi-CELL BLU. Pour l'activation des DC, 6 × 104 DC ont été cultivées avec un traitement SNA dans un volume final de 200 μl pendant une impulsion de 30 min. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du RPMI+/+ et laissées pendant 22 h dans un incubateur, après quoi les cellules ont été lavées avec du PBS pour terminer le traitement, colorées pendant 15 min à 4 °C en utilisant 0,5 µl de chaque anticorps par tube (L/D, CD11c, CD86 et CD80), lavées avec du PBS et fixées avec 100 µl de tampon de fixation (BioLegend, 420801). Pour les études utilisant un bloqueur du MHC-I, les cellules ont d'abord été incubées pendant 30 min dans un volume de 100 μl avec 25 μg ml-1 d'anti-MHC-I (BioXCell, E0077). Par la suite, des SNA dans un volume de 100 ul ont été ajoutés à la solution de cellule et de bloqueur et les échantillons ont été pulsés pendant 30 min. Les étapes restantes suivent le protocole ci-dessus. Pour évaluer la spécificité et l'activation des lymphocytes T, 1, 6 × 105 DC purifiées ont été pulsées avec un traitement SNA pendant 30 min dans l'incubateur dans un volume final de 200 μl. Après l'impulsion de 30 min, les cellules ont été lavées deux fois avec du RPMI+/+ pour éliminer tout SNA résiduel de la solution cellulaire, et les cellules ont été remises en suspension dans 500 ul de RPMI+/+. Parallèlement, des splénocytes ont été isolés à partir d'une souris naïve. Après dissociation de la rate et lyse des globules rouges, les cellules ont été comptées et remises en suspension à une concentration de 3 × 106 cellules par ml dans du RPMI+/+ chauffé, et 100 µl de cette solution cellulaire ont été transférés dans chaque puits d'une plaque à fond rond de 96 puits. Dans chaque puits, 100 μl de DC traitées (3,3 × 104 cellules) ont été ajoutés de sorte que le rapport DC: splénocytes était de 1: 9. Les cellules ont été co-cultivées pendant 3 jours dans l'incubateur, après quoi les cellules ont été lavées avec du PBS et colorées en suivant les instructions du fabricant pour la protéine de fusion DimerX Mouse H-2Kb:Ig (BD, 552944) ou OVA2 Tetramer (ProImmune). Les anticorps de coloration en plus des marqueurs TCR spécifiques du peptide comprenaient L/D, CD8 ou CD4, CD19 et CD69. Après coloration, les cellules ont été fixées avec 100 µl de tampon de fixation. Pour évaluer la prolifération des lymphocytes T, 2, 6 × 105 DC purifiées ont été pulsées avec un traitement SNA pendant 30 min dans l'incubateur dans un volume final de 200 μl. Après l'impulsion de 30 min, les cellules ont été lavées deux fois avec du RPMI+/+ pour éliminer tout SNA résiduel de la solution cellulaire, et les cellules ont été remises en suspension dans 266,6 μl de RPMI+/+. Parallèlement, des splénocytes ont été isolés d'une souris C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT1) (Jackson, 003831). Après dissociation de la rate et lyse des globules rouges, les cellules ont été comptées et remises en suspension à une concentration de 4 × 107 cellules par ml dans du PBS pour coloration avec le colorant de prolifération cellulaire eFluor 450 (eBioscience, 65-0842-85), en suivant les instructions du fabricant. Après coloration, les cellules ont été lavées, comptées et remises en suspension dans du RPMI+/+ à une concentration de 3 x 106 cellules par ml ; 100 µl de cette solution cellulaire ont été transférés dans chaque puits d'une plaque 96 puits à fond rond. Dans chaque puits, 33,3 μl de DC traitées (3,3 × 104 cellules) ont été ajoutés de sorte que le rapport DC: splénocytes soit de 1: 9, et chaque puits a été porté à 200 μl de volume final avec du milieu. Les cellules ont été co-cultivées pendant 3 jours dans l'incubateur, après quoi les cellules ont été lavées avec du PBS, colorées pour CD8 (0,5 μl d'anticorps par tube), lavées et immédiatement analysées par cytométrie en flux en utilisant une dilution d'eFluor 450 comme mesure de la prolifération des cellules T. Tous les échantillons ont été analysés à l'aide d'un cytomètre en flux BD A3 Symphony, avec des données analysées sur FlowJo.

Des souris femelles C57BL/6 ont été immunisées par voie sous-cutanée tous les quinze jours 3 fois avec différents traitements. Traitements inclus : mélange simple (mélange, 6 nmol de chaque peptide et 6 nmol d'ADN CpG 1826), soit DA-SNA (6 nmol de peptide OVA et CpG 1826), soit des formulations séparées équivalentes de DA-SNA (6 nmol de peptide OVA et CpG 1826) ou un DA-SNA hybride double (appelé « HH » ; 6 nmol de peptide OVA et 12 nmol de CpG 18 26). Le volume de traitement injecté a été maintenu à 100 µl. Une semaine après l'immunisation finale, les souris ont été tuées et les rates ont été prélevées pour une évaluation immunitaire ultérieure.

Les rates retirées ont été collectées et conservées temporairement dans 3 à 5 ml de RPMI + / + jusqu'à ce que toutes les rates aient été collectées, puis elles ont été passées à travers un tamis cellulaire de 70 μm avec un flux constant de PBS. Les cellules ont été centrifugées à 1 200 tr/min pendant 5 min, après quoi le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 2 à 3 ml de tampon de lyse ACK (Gibco, A1049201) pendant 4 min. Pour diluer le tampon de lyse, du PBS a ensuite été ajouté à un volume final de 30 ml, et les cellules ont été comptées avant centrifugation pour être remises en suspension dans du milieu RPMI+/+ à une concentration de 1 x 108 cellules par ml.

Les lymphocytes T ont été restimulés ex vivo pour évaluer la production d'IFN-γ intracellulaire spécifique de l'antigène. Les splénocytes (4 × 106) ont été cultivés pendant 4 h à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 avec 450 μl de milieu RPMI + / + contenant: peptide OVA1 ou OVA2 (10 μg ml-1), monensin (2 μM), Brefeldin A (5 μg ml-1) et anticorps CD107a (0, 5 μl). Après 4 h d'incubation, les cellules ont été centrifugées à 1 200 tr/min pendant 5 min, aspirées et lavées avec 600 μl de PBS avant 15 min de coloration avec des anticorps de surface (0,5 μl par échantillon chacun de : L/D, CD8 et CD4) à 4 °C. Les cellules ont été lavées avec 600 μl de PBS, centrifugées à 1 200 tr/min pendant 5 min, aspirées et remises en suspension dans 100 μl de solution de fixation et de perméabilisation Cytofix (BD, 554722) pendant 20 min à 4 °C. Les cellules ont ensuite été lavées avec 600 µl de tampon Perm/Wash (BD, 554723), centrifugées à 1200 rpm pendant 5 min, aspirées et resuspendues dans 100 µl de tampon Perm/Wash contenant l'anticorps intracellulaire IFN-γ (0,5 µl par échantillon). Les échantillons ont été conservés à 4°C avant l'analyse par cytométrie en flux.

Les lymphocytes T ont été évalués pour le phénotype de la mémoire effectrice. Les splénocytes (3 × 106) ont été lavés avec 600 μl de PBS et colorés pendant 15 min avec des anticorps de surface (0,5 μl par échantillon chacun de : L/D, CD8, CD4, CD44 et CD62L) à 4 °C. Les cellules ont été lavées avec 600 μl de PBS, centrifugées à 1 200 tr/min pendant 5 min, aspirées, remises en suspension dans 100 μl de tampon de fixation (BioLegend, 420801) et conservées à 4 °C avant l'analyse par cytométrie en flux.

L'analyse ELISpot a été effectuée à l'aide de l'ensemble ELISPOT INF-γ pour souris disponible dans le commerce (BD, 551083) en suivant les instructions du fabricant. En bref, la plaque propre fournie a été recouverte d'anticorps de capture pendant une nuit à 4 ° C. Puis la plaque a été lavée avec du milieu RPMI+/+ puis bloquée pendant 2 h à température ambiante avec 200 µl de milieu RPMI+/+. Le tampon de blocage a été retiré par pipetage, en veillant à ne pas laisser sécher les puits, et rapidement remplacé par 2 × 105 splénocytes dans 100 μl de RPMI+/+. Dans chaque puits, 100 μl supplémentaires d'antigène, de peptide non spécifique, de milieu (contrôle négatif) ou de solutions de contrôle positif ont été ajoutés (l'antigène et le peptide non spécifique ont été ajoutés à une concentration finale de 5 μg ml-1 ; le contrôle positif a été préparé sous la forme d'un mélange d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28 à une concentration finale de 2 μg ml-1 chacun). Les solutions ont été laissées dans un incubateur à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 48 h. Après cette incubation, la plaque a été lavée et l'anticorps de détection, le conjugué enzymatique et le substrat chromogénique ont été ajoutés selon les instructions du fabricant. La plaque séchée a été imagée et analysée à l'aide d'un imageur CTL Immunospot.

Pour évaluer l'absorption et le trafic intracellulaire des DA-SNA, les BMDC ont été prélevés sur des fémurs murins et purifiés pour CD11c + (comme décrit ci-dessus) puis ensemencés sur des lames à 8 chambres (Lab-Tek, 155409) à 50 000 cellules par puits. Après une nuit d'incubation, les cellules ont été traitées avec des DA-SNA (2, 5 μM) contenant des antigènes OVA1 et OVA2 marqués au fluorophore pendant 0, 5, 1, 6 ou 24 h. Pendant 6 et 24 h, les cellules ont été pulsées pendant 2 h avec des DA-SNA et remplacées par du milieu frais pour le temps restant. Après incubation aux moments indiqués, les cellules ont ensuite été fixées pendant 15 min (BioLegend) et bloquées avec 5 % de BSA (ThermoFisher) dans du PBS contenant 0,1 % de Triton-X pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été colorées pour les marqueurs organites en utilisant des anticorps primaires pour EEA1 (ratio 1:700, Abcam), Rab7 (1:500, Abcam), LAMP1 (1:200, ABclonal), PDI (1:50, Cell Signaling), MHC-I (1 μg ml-1, BioXCell) et MHC-II (1 μg ml-1, BioXCell) pendant une nuit à 4 ° C avant le marquage secondaire avec Alexa Fluor 555 (EEA1, Rab7, LAMP1 et PDI ; Abcam ab150078) et Alexa Fluor 594 (MHC-I et MHC-II ; ThermoFisher A48264) pendant 1 h à 4 °C. Les noyaux cellulaires ont été colorés avec du DAPI pendant 1 min et stockés dans du PBS jusqu'à l'imagerie. L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un microscope Zeiss LSM 800, en conservant les mêmes paramètres pour toutes les images. Le coefficient de chevauchement de Mander a été calculé à l'aide du logiciel ZEN (Zeiss). Pour les études sur les inhibiteurs (y compris celles effectuées par flux), les cellules ont été ensemencées à 150 000 cellules par puits. Après une nuit d'incubation, les cellules ont été incubées avec de la chloroquine (5 μM, Sigma), de la bréfeldine A (2 μg ml-1, BioLegend) ou de la leupeptine (100 μM, Sigma) pendant 1 h. Après 1 h d'incubation, des milieux contenant du DA-SNA (2, 5 μM) et les inhibiteurs indiqués ont été ajoutés et puisés pendant 1 h supplémentaire. Après avoir puisé avec des DA-SNA, les puits ont été lavés avec du milieu puis remplacés par du milieu contenant des inhibiteurs pendant une durée totale d'incubation de 24 h. La coloration des organites a été effectuée comme décrit ci-dessus.

Des cellules dendritiques, des lymphocytes T CD4+ et CD8+ ont été isolées à partir de splénocytes entiers de groupes de traitement individuels après trois immunisations sous-cutanées bimensuelles à l'aide de kits de sélection positive magnétique (Stemcell Technologies, 17665, 18952 et 18953). A partir de ces populations de cellules isolées, l'extraction d'ARN a été réalisée à l'aide d'un mini kit RNeasy Plus (Qiagen) en combinaison avec des QIAshredders (Qiagen) selon les spécifications du fabricant. La concentration d'ARN a été quantifiée à l'aide d'un NanoDrop 8000 (ThermoFisher) et les échantillons d'ARN ont été stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation ultérieure. Le séquençage a été effectué à la Northwestern University NUSeq Core Facility. En bref, la qualité des exemples d'ARN total a été vérifiée à l'aide des numéros d'intégrité de l'ARN (RIN) générés par Agilent Bioanalyzer 2100. La quantité d'ARN a été confirmée avec un fluorimètre Qubit. Le kit Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Preparation a été utilisé pour préparer des bibliothèques de séquençage à partir de 125 ng d'échantillons d'ARN de haute qualité (RIN > 7). La procédure du kit, y compris la purification et la fragmentation de l'ARNm, la synthèse de l'ADNc, l'adénylation de l'extrémité 3', la ligature de l'adaptateur Illumina, l'amplification et la validation de la bibliothèque PCR, a été effectuée sans modifications. Les bibliothèques ont été séquencées à l'aide d'un séquenceur Illumina HiSeq 4000 pour générer des lectures uniques de 50 pb à une profondeur de 20 à 25 millions de lectures par échantillon. La qualité des lectures, au format FASTQ, a été évaluée à l'aide de FastQC. Les lectures ont été coupées pour supprimer les adaptateurs Illumina des extrémités 3 'à l'aide de cutadapt57. Les lectures coupées ont été alignées sur le génome de Mus musculus (mm10) à l'aide de STAR58. Le nombre de lectures pour chaque gène a été calculé à l'aide de htseq-count59 en conjonction avec un fichier d'annotation de gène pour mm10 obtenu auprès d'Ensembl (http://useast.ensembl.org/index.html). La normalisation et l'expression différentielle ont été calculées à l'aide de DESeq2 utilisant le test de Wald60. Le seuil pour déterminer les gènes exprimés de manière significativement différentielle était une valeur P ajustée au taux de fausses découvertes (FDR) inférieure à 0, 05 en utilisant la méthode Benjamini-Hochberg.

GSEA61 a été réalisée pour comprendre si les gènes exprimés de manière différentielle étaient connectés à des voies différentiellement enrichies. Les gènes détectés avec le séquençage de l'ARN ont été classés sur la base des valeurs P nominales transformées en log10 obtenues à partir de l'analyse DeSeq2 et ont été comparés aux cellules T naïves. L'analyse d'enrichissement des voies a été réalisée à l'aide du logiciel GSEA (v4.0.3) et en suivant le protocole de la réf. 62. Les ensembles de gènes ont été obtenus à partir de la base de données des signatures moléculaires et comprenaient Reactome et KEGG. La liste classée a été remappée à l'aide d'une technologie CHIP de la base de données des signatures moléculaires qui a utilisé le symbole du gène de la souris pour remapper les orthologues humains (v7.1). Un terme était défini comme différentiellement enrichi s'il avait un FDR < 0,05. Un sous-ensemble de voies fortement enrichies a été sélectionné pour la visualisation dans R à l'aide du package pheatmap (v1.0.12). Cette sélection incluait toutes les voies avec un FDR < 0,05 et était pertinente pour les réponses immunitaires dans les lymphocytes T dendritiques, CD8+ et CD4+.

Les gènes dont l'expression était significativement modifiée dans les deux groupes de traitement SNA, tels que définis par FDR P <0, 05, ont été sélectionnés pour être visualisés sous forme de cartes thermiques. Les scores d'expression génique dans FPKM ont été convertis en scores z dans les groupes de traitement et les valeurs d'expression génique regroupées à l'aide du clustering K-means. Des combinaisons par paires ont été réalisées entre deux conditions d'intérêt, en définissant des lymphocytes T CD4+ ou CD8+ naïfs comme témoins. Les gènes régulés à la hausse ou à la baisse entre les groupes, tels que définis par FDR P <0, 05 et un changement de facteur log2> 0, 5 (régulé à la hausse) ou un changement de facteur log2 <0, 05 (réglé à la baisse) ont été visualisés à l'aide d'un diagramme de volcan.

Des souris C57BL/6 femelles âgées de 8 à 12 semaines ont été acquises auprès du Jackson Laboratory. L'inoculation de la tumeur a été réalisée en injectant par voie sous-cutanée (sc) aux animaux 5 × 105 E.G7-OVA, 105 B16-F10 ou 5 × 105 cellules MC-38 dans le flanc droit. Les immunisations ont été administrées à une dose de 6 nmol (OVA1/2 et Adpgk I/II) ou 9 nmol (M27/30) de chaque antigène et CpG par injection sous-cutanée dans l'abdomen. Les immunisations ont été administrées comme indiqué dans le programme de traitement fourni dans les figures respectives. Pour la thérapie combinée avec l'inhibiteur de point de contrôle immunitaire anti-PD-1, les souris ont reçu 100 μg d'anti-souris PD-1 (clone RMP1-14, BioXCell) par injection intrapéritonéale. La croissance tumorale a été mesurée à des jours prédéterminés et le volume a été calculé à l'aide de l'équation suivante : volume tumoral = longueur × largeur2 × 0,5. Les animaux ont été euthanasiés lorsque les volumes tumoraux ont atteint 2 000 mm3 (E.G7-OVA) ou 1 500 mm3 (B16-F10, MC-38) ou lorsque l'animal est devenu moribond.

La biodistribution des DA-SNA aux principaux organes a été réalisée chez des souris femelles C57BL/6 (n = 3) à l'aide de peptides OVA marqués au fluorophore et d'une dose unique à 6 nmol administrée sous-cutanée Après 24 h, des organes entiers ont été prélevés et stockés brièvement dans du PBS jusqu'à l'imagerie. L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un système d'imagerie in vivo (IVIS) avec des filtres d'excitation/émission réglés pour 500/540 (FITC) et 640/680 (Cy5). Les antigènes hybrides ont été marqués à l'aide d'un colorant fluorescent Cy5, tandis que les antigènes encapsulés ont été marqués à l'aide d'un colorant fluorescent FITC. Les données ont été quantifiées en mesurant avec le logiciel Living Image v4.5. Les rates recueillies à partir de l'analyse de biodistribution ont été écrasées à travers une passoire cellulaire de 70 μm après imagerie. Les cellules ont été culottées à 1 200 tr/min pendant 5 min et les cellules ont été remises en suspension dans un tampon de lyse ACK (Gibco) pendant 4 à 5 min. Les cellules ont été diluées dans du PBS jusqu'à environ 25 à 30 ml et comptées. Trois millions de cellules ont été placées dans des tubes d'écoulement et lavées avec du PBS. Les cellules ont été incubées avec une solution de coloration contenant 0, 5 μl de chacun de: UV vivants / morts fixables et CD11c (clone N418, PE) pendant 15 min à 4 ° C dans 100 μl de PBS. Le surnageant a été éliminé après un lavage et une centrifugation, et les cellules ont été fixées dans 100 μl de tampon de fixation (BioLegend, 420801) et stockées à 4 ° C avant la cytométrie en flux.

Pour la collecte des PBMC, les animaux ont été inoculés avec des cellules cancéreuses comme décrit ci-dessus. Le traitement a été effectué selon le même schéma et les animaux ont été euthanasiés au jour 15 (E.G7-OVA), au jour 16 (MC-38) ou au jour 17 (B16-F10). Le sang a été prélevé par ponction cardiaque dans des tubes de prélèvement doublés d'EDTA (BD) et brièvement mélangé par inversion. Les globules rouges ont été lysés en utilisant un tampon de lyse ACK (Gibco) et lavés, et les cellules restantes ont ensuite été colorées en utilisant les méthodes décrites ci-dessus avec des anticorps pour L/D, CD4, CD8, CD19, CD44, CD62L et dimère ou pentamère spécifique de l'antigène, et tétramère (E.G7-OVA, B16-F10) ou L/D, CD8, CD19 et pentamère spécifique de l'antigène (MC-38).

Les poids des tumeurs et l'évaluation des splénocytes ont été effectués sur des souris C57BL/6 portant une tumeur E.G7-OVA dans le flanc droit. 3 jours après l'inoculation de la tumeur, la première immunisation a été administrée, suivie d'une dose supplémentaire 7 jours plus tard (jour 10). Les tumeurs et les rates ont été excisées des animaux au jour 15 et ensuite analysées. L'évaluation du microenvironnement tumoral a été réalisée sur des souris C57BL/6 portant une tumeur MC-38 dans le flanc droit. 3 jours après l'inoculation de la tumeur, la première immunisation a été administrée, suivie d'une dose supplémentaire 7 jours plus tard (jour 10). Les tumeurs ont été excisées des animaux au jour 16 et ensuite analysées. Pour générer des solutions unicellulaires, les tumeurs ont été forcées mécaniquement à travers une passoire cellulaire de 70 μm tout en maintenant l'hydratation dans une solution PBS. Les cellules ont ensuite été centrifugées à 1200 tr/min pendant 5 min. Le culot de rate a été remis en suspension dans un tampon de lyse ACK (ThermoFisher) pendant 4 min pour lyser les globules rouges, puis neutralisé dans du PBS avant centrifugation. Après centrifugation, les cellules ont été marquées à l'aide des anticorps suivants : E.G7-OVA : CD4, CD8, CD19 et L/D ; MC-38 : CD4, CD8, CD45, CD11b, Gr-1 et L/D.

Les statistiques ont été calculées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 9, et les analyses statistiques spécifiques utilisées sont mises en évidence dans les légendes des figures respectives. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été analysées avec une analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec un test de comparaisons multiples de Šidák ou de Tukey, ou une ANOVA de Welch avec un test de comparaisons multiples de Dunnett en raison du manque d'hypothèses qui pourraient être faites sur la base de grandes différences de sd entre les groupes. Les statistiques de survie des animaux ont été calculées à l'aide d'un test du log-rank. Les valeurs aberrantes pour les Fig. 5e, f et Fig. 6h, j ont été identifiées à l'aide de la méthode ROUT avec un Q fixé à 10 % ou 1 %, respectivement. Pour tous les cas, les valeurs P sont représentées comme suit : *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001. L'attribution des animaux à chaque groupe, les immunisations administrées et les mesures pour les études ont été effectuées en aveugle. Les valeurs dans les graphiques sont représentées par la moyenne ± sem ou sd, et cela, ainsi que les tailles d'échantillon, sont indiqués dans les légendes respectives des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données qui appuient les conclusions de cette étude sont disponibles dans le document et ses informations supplémentaires. Toutes les données générées dans cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par le Polsky Urologic Cancer Institute du Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center de l'Université Northwestern du Northwestern Memorial Hospital, Edward Bachrach et le National Cancer Institute des National Institutes of Health Awards R01CA208783, R01CA257926 et P50CA221747. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. MHT reconnaît le soutien du programme de formation en nanotechnologie du cancer de la Northwestern University Award T32CA186897. ME a été partiellement soutenu par la bourse Dr John N. Nicholson et la Fondation d'intérêt public Alexander S. Onassis. La synthèse peptidique a été réalisée, avec des remerciements particuliers à M. Karver, au Peptide Synthesis Core Facility de l'Institut Simpson Querrey de l'Université Northwestern, qui bénéficie actuellement du soutien de la ressource Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) (NSF ECCS-2025633). Ce travail a fait appel à l'installation IMSERC MS de la Northwestern University, avec des remerciements particuliers à S. Shafaie ; cette installation MS a reçu le soutien de la ressource SHyNE (Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental) (NSF ECCS-2025633), de l'État de l'Illinois et de l'Institut international de nanotechnologie (IIN). Ce travail a été soutenu par la Northwestern University NUSeq Core Facility.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Michelle H. Teplensky, Michael Evangelopoulos.

Département de chimie et Institut international de nanotechnologie, Northwestern University, Evanston, Illinois, États-Unis

Michelle H. Teplensky, Connor M. Forsyth et Chad A. Mirkin

Département de génie biomédical, Northwestern University, Evanston, Illinois, États-Unis

Michael Evangelopoulos, Jasper W. Dittmar, Andrew J. Sinegra et Chad A. Mirkin

Programme interdisciplinaire de sciences biologiques, Northwestern University, Evanston, Illinois, États-Unis

Connor M. Forsyth, Shuya Wang et Chad A. Mirkin

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MHT, ME et CAM ont conçu les expériences. MHT, ME, JWD, CMF et SW ont réalisé les expériences. MHT et AJS ont analysé les données de séquençage. MHT et ME ont analysé toutes les autres données, que tous les auteurs ont examinées. MHT, ME et CAM ont rédigé la première ébauche du manuscrit. Tous les auteurs ont révisé et édité le manuscrit.

Correspondance avec Chad A. Mirkin.

CAM et MHT ont des intérêts financiers dans Flashpoint Therapeutics Inc., qui pourrait potentiellement bénéficier des résultats de cette recherche.

Nature Biomedical Engineering remercie Jeffrey Hubbell et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, expression dans les cellules dendritiques de marqueurs de co-stimulation avec une gamme de concentrations et plusieurs ensembles de peptides et avec un bloqueur du CMH-I. Légende des différents traitements de cette étude. b, L'expression (mesurée par l'intensité de fluorescence médiane (MFI)) de CD80 (à gauche) et de CD86 (à droite) sur CD11c + DC basée sur la livraison des deux classes d'antigènes sur des nanoparticules séparées ou sur un DA-SNA singulier. Une gamme de concentrations (par CpG et chaque antigène) a été testée. c, L'ajout d'un anticorps bloquant anti-MHC-I aux cellules dendritiques dans l'ensemble n'a pas conduit à un changement important du MFI du signal CD80 (gauche) ou CD86 (droite). Tous les changements de facteur dans les IMF sont autour de 1, ce qui n'indique aucune différence. d, Expression de CD80 (à gauche) et de CD86 (à droite) avec des formulations de SNA contenant des néo-antigènes M27 et M30. Pour tous les panels, moyenne ± sem indiquée pour n = 3. Signification statistique indiquée entre les comparaisons pertinentes à l'aide de l'ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples de Tukey.

a, Réponses immunitaires in vivo déclenchées en fonction du placement et de la formulation de l'antigène, y compris une nanostructure combinée à double hybridation (HH). Calendrier d'immunisation bimensuelle pour les souris C57BL/6. Dose : 6 nmol de chaque antigène ; 6 nmol d'adjuvant. Différents groupes de vaccination indiqués dans la légende. b, Modification des populations de cellules CD8+ (à gauche) ou CD4+ (à droite) dans la rate après le schéma de vaccination. c, la production intracellulaire de cytokine pro-inflammatoire IFN-γ (à gauche) ou de marqueur de dégranulation CD107a (au milieu) a été évaluée lors d'une restimulation ex vivo avec un antigène peptidique; Analyse des lymphocytes T CD8+ avec stimulation OVA1 (en haut), analyse des lymphocytes T CD4+ avec stimulation OVA2 (en bas). Les lymphocytes T polyfonctionnels (doublement positifs pour les deux marqueurs) ont été quantifiés (à droite). d, Phénotype de la mémoire effectrice, mesuré par les marqueurs CD44+CD62L−. e, Pourcentage de lymphocytes T CD8 + spécifiques à OVA1, mesuré par coloration avec un dimère spécifique de l'antigène. Moyenne ± sem indiquée ; n = 3-6 souris par groupe. La signification statistique entre les comparaisons pertinentes est indiquée. Pour tous les panels, la signification a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey (b, c, d) ou de Dunnett (e).

ac, des souris C57BL/6 ont été inoculées par voie sous-cutanée avec des cellules MC-38 (5 × 105) dans le flanc droit et ont reçu des immunisations hebdomadaires à partir du jour 3 pour un total de quatre vaccinations (6 nmol d'adjuvant, 6 nmol de chaque antigène). Les courbes de croissance tumorale moyenne, le volume tumoral au jour 24 et la survie des animaux sont indiqués. df, analyse par cytométrie en flux de cellules isolées de tumeurs au jour 16 recevant le programme indiqué en a. d, Évaluation des lymphocytes T CD8+ et e, CD4+ parmi les cellules immunitaires CD45+. f, évaluation des cellules suppressives dérivées de la myéloïde Gr-1 + CD11b + dans les cellules immunitaires CD45 +. g, analyse par cytométrie en flux des PBMC au jour 16 isolées de souris porteuses de tumeurs selon le schéma décrit en a. Cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène Adpgk 1. h, Cellules formant des taches totales (SFC) mesurées par dosage ELISpot (à gauche) des lymphocytes T spléniques sécrétant de l'IFN-γ lors de différentes stimulations ex vivo. Chiffres et images représentatifs (à droite). La stimulation ex vivo de l'antigène non spécifique n'a entraîné aucun SFC, ce qui met en évidence la spécificité de la réponse. Pour ac, les données montrent la moyenne ± sem de deux expériences indépendantes (n = 6-9). Pour dh, les données montrent une moyenne ± sem avec n = 6 par groupe, certains groupes ayant moins de points individuels affichés si les tumeurs n'étaient pas présentes au jour 16. Pour les panels b, dg, la signification a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey. Pour le panel h, la signification a été calculée à l'aide d'une ANOVA de Welch suivie d'un test de comparaisons multiples de Dunnett en raison de différences significatives entre les groupes dans l'écart type. La survie des animaux dans le panel c a été analysée à l'aide d'un test Log-rank. ns = non significatif.

Données source

Figures, tableaux et références supplémentaires.

RNAseq des cellules dendritiques et rapports sur la GSEA et les gènes.

Rapports RNAseq et GSEA des lymphocytes T.

T-cell RNAseq et liste des gènes significatifs.

Données sources pour les courbes de croissance tumorale.

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Réimpressions et autorisations

Teplensky, MH, Evangelopoulos, M., Dittmar, JW et al. Vaccins anticancéreux à acides nucléiques sphériques multi-antigènes. Nat. Biomédical. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-01000-2

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Reçu : 02 septembre 2021

Accepté : 19 décembre 2022

Publié: 30 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-022-01000-2

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