Système d'ensemencement à cellules rotatives sphériques pour la production de petites

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3001 (2023) Citer cet article

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Des vaisseaux sanguins issus de l'ingénierie tissulaire humaine entièrement biologiques (TEBV) ont déjà été développés pour une utilisation clinique. Les modèles d'ingénierie tissulaire se sont également révélés être des outils précieux dans la modélisation des maladies. De plus, il existe un besoin de TEBV à géométrie complexe pour l'étude des pathologies vasculaires multifactorielles, telles que les anévrismes intracrâniens. L'objectif principal des travaux rapportés dans cet article était de produire un TEBV ramifié de petit calibre entièrement humain. L'utilisation d'un nouveau système d'ensemencement cellulaire rotatif sphérique permet un ensemencement cellulaire dynamique efficace et uniforme pour un modèle d'ingénierie tissulaire in vitro viable. Dans ce rapport, la conception et la fabrication d'un système d'ensemencement innovant avec une rotation sphérique aléatoire de 360° sont décrites. Des chambres d'ensemencement sur mesure sont placées à l'intérieur du système et contiennent des échafaudages en polyéthylène téréphtalate glycol (PETG) en forme de Y. Les conditions d'ensemencement, telles que la concentration cellulaire, la vitesse d'ensemencement et le temps d'incubation ont été optimisées par le nombre de cellules collées sur les échafaudages PETG. Cette méthode d'ensemencement sphérique a été comparée à d'autres approches, telles que l'ensemencement dynamique et statique, et montre clairement une distribution cellulaire uniforme sur les échafaudages PETG. Avec ce système sphérique simple à utiliser, des constructions TEBV ramifiées entièrement biologiques ont également été produites en ensemençant des fibroblastes humains directement sur des mandrins PETG à géométrie complexe sur mesure. La production de TEBV de petit calibre dérivés de patients avec une géométrie complexe et une distribution cellulaire optimisée tout au long de la reconstruction vasculaire peut être une manière innovante de modéliser diverses maladies vasculaires telles que les anévrismes intracrâniens.

L'avancement des greffes vasculaires issues de l'ingénierie tissulaire ces dernières années présente une option clinique prometteuse pour le traitement des maladies vasculaires ou pour fournir des modèles in vitro alternatifs pour étudier ces troubles complexes1,2. Grâce au raffinement du modèle, il est désormais possible de produire des vaisseaux sanguins issus de l'ingénierie tissulaire (TEBV) avec des antécédents génétiques définis pour mieux comprendre la pathobiologie derrière les maladies vasculaires3,4. Différentes techniques pour générer des TEBV ont été développées au fil des ans, chacune présentant des avantages et des inconvénients, et peuvent être classées en trois catégories principales : (1) les conduits vasculaires constitués de cellules ensemencées sur des échafaudages manufacturés, (2) les conduits vasculaires fabriqués par ingénierie des feuilles cellulaires et (3) la bio-impression5,6. L'un des défis de l'ingénierie tissulaire vasculaire reste cependant d'améliorer l'ensemencement, la distribution et l'organisation cellulaires pour incorporer de manière homogène des cellules sur une structure tubulaire. Par conséquent, les techniques d'ensemencement cellulaire dynamique se sont imposées sur des approches statiques plus simples7,8,9. De plus, dans un environnement tridimensionnel (3D), une distribution cellulaire surveillée uniformément est nécessaire pour favoriser le remodelage homogène des tissus et pour éviter la compétition pour les nutriments dans les zones à densité cellulaire plus élevée10,11,12,13. L'état actuel de l'ensemencement cellulaire dynamique permet une production facile de TEBV linéaire avec l'utilisation de bouteilles en rouleau et l'ensemencement perfusé de cellules endothéliales dans une construction tubulaire. Cependant, ceux-ci ne sont pas idéaux pour la production de TEBV tri-couche à géométrie plus complexe composée d'une adventice, d'une média et d'une intima tunica4,14,15,16.

Auparavant, il a été démontré que la production de vaisseaux sanguins linéaires de petit calibre auto-assemblés ensemencés sur du polyéthylène téréphtalate glycol (PETG) prétraité aux rayons ultraviolets-C (UV-C) assurait une bonne fixation cellulaire et une sécrétion/assemblage optimisée de la matrice extracellulaire (ECM)14. Pour produire des TEBV à géométrie complexe et améliorer l'ensemencement cellulaire le long des échafaudages, nous avons développé un système rotatif avec un mouvement de rotation aléatoire permettant une distribution cellulaire efficace et uniforme. Nous décrivons ici la conception et la fabrication d'un système d'ensemencement rotatif innovant capable d'effectuer une rotation complète de 360 ° et de produire des adventices vasculaires entièrement biologiques à ingénierie tissulaire (TEBV-A).

Le cahier des charges initial pour la conception de ce nouveau système de semis rotatif était une rotation à 360° à vitesse réglable, un temps de fonctionnement d'au moins 24 h, et une capacité de production d'un maximum de cinq TEBV simultanément. La conception a été conçue pour être simple, directe et facile à utiliser (Fig. 1A). Ce modèle comprend une sphère en acrylique composée de deux moitiés mises en mouvement de rotation sphérique par deux moteurs sur une plaque de support afin que les TEBV puissent être produits à l'intérieur des chambres d'ensemencement maintenues au milieu de la sphère (Fig. 1B – E). Ce système de semis a été adapté pour avoir une rotation aléatoire de 360°. La rotation est considérée comme aléatoire car la vitesse constante des moteurs est utilisée tout au long du temps d'ensemencement et les imperfections de la forme de la sphère provoquent des changements dans l'axe de mouvement (Vidéo supplémentaire 1). Le système a également une vitesse réglable de 63 à 135°/minute, un temps de fonctionnement de plus de 24 h et une capacité de production de cinq TEBV (Fig. 1F). Il peut également être placé dans un environnement à température contrôlable pendant la durée de l'étape d'ensemencement.

Système de semis rotatif. (A) Conception assistée par ordinateur (CAO) du système avec le logiciel CREO 5.0 avec indicateurs directionnels ; (B,C) photographies des moitiés mâle et femelle de la sphère acrylique avec anneau de fermeture imprimé en 3D et plaques pour maintenir les chambres d'ensemencement en place ; (D) plaque de support en aluminium avec trois supports de type roulement à billes, deux moteurs et une unité de commande électronique ; (E) cinq chambres d'ensemencement de cellules acryliques sur mesure ; (F) système de semis rotatif assemblé. Barre d'échelle = 5 cm.

Des chambres d'ensemencement sur mesure ont été conçues pour ensemencer des cellules de fibroblastes humains sur des échafaudages PETG ramifiés (Fig. 2). Les chambres sont composées de deux moitiés en polycarbonate avec des empreintes en forme de Y usinées sur mesure adaptées pour loger des échafaudages PETG en forme de Y de 4,8 mm de diamètre (Fig. 2A–C). Ces échafaudages sont constitués de trois parties distinctes maintenues ensemble par des goupilles en acier inoxydable afin que les différentes branches puissent être retirées pour un démontage facile. La moitié inférieure a un joint torique en forme de Y, pour rendre la chambre étanche et la moitié supérieure, a trois petites ouvertures permettant d'ajouter des cellules et des milieux de culture (Fig. 2A). Les deux moitiés sont maintenues ensemble par du matériel en acier inoxydable. Toutes les pièces utilisées pour les chambres peuvent être stérilisées par autoclavage puis utilisées sous une hotte biologique en utilisant une technique aseptique pour ensemencer des cellules humaines (Fig. 2D). Cinq des chambres d'ensemencement fermées doivent être placées à l'intérieur du système rotatif pour que la sphère puisse fonctionner correctement (Fig. 2E).

Chambres de semis ramifiées sur mesure. (A) CAO du système avec le logiciel CREO 5.0 de la moitié inférieure de la chambre d'ensemencement acrylique avec tiret en forme de Y et joint torique en forme de Y ; (B) CAO d'un échafaudage PETG en forme de Y personnalisé avec des goupilles en acier inoxydable ; (C) CAD de la chambre d'ensemencement complète fermée avec du matériel et vue des petites vis pour les ports d'ensemencement ; (D) photographie de toutes les pièces et du matériel des chambres d'ensemencement à l'intérieur de la hotte biologique sur un champ stérile ; (E) photographie de la chambre complète fermée avec du matériel et vue des petites vis pour le port d'ensemencement. Barre d'échelle = 1 cm.

Pour déterminer les paramètres optimaux d'ensemencement cellulaire, nous avons d'abord testé différentes concentrations cellulaires. Trois concentrations cellulaires initiales, indiquées ici en millions de cellules par millilitre de milieu de culture (M/mL), ont été utilisées (0,1 M/mL, 0,15 M/mL et 0,30 M/mL) pour ensemencer les chambres. Les cellules ont été laissées adhérer à un mandrin en PETG de 4,8 mm de diamètre pendant une période de 22 h à une vitesse moyenne de 90°/min. Les mandrins ensemencés de cellules ont ensuite été incubés avec de la trypsine pendant 10 minutes et les cellules détachées ont été comptées. Une concentration cellulaire de 0,15 M/mL s'est avérée être le meilleur paramètre d'ensemencement cellulaire (0,15 M/mL comparé à 0,1 M, P < 0,0010 ; 0,15 M/mL comparé à 0,3 M/mL, P = 0,3805) (Fig. 3A). Aucune différence significative n'a été observée entre les conditions pour le nombre de cellules dans le surnageant après l'ensemencement (Fig. 3A). A partir de cette concentration cellulaire optimale, nous avons ensuite voulu déterminer la meilleure vitesse d'ensemencement, c'est-à-dire la vitesse optimale pour mettre en place le système de rotation sphérique permettant au plus grand nombre de cellules d'adhérer à l'échafaudage. Trois vitesses de semis différentes ont été testées (63°/min, 90°/min et 135°/min). Le nombre de cellules adhérant à l'échafaudage PETG s'est avéré significativement plus élevé lors de l'utilisation de la vitesse d'ensemencement moyenne de 90 ° / min (63 ° / min par rapport à 90 ° / min; P = 0, 0321 et 90 ° / min par rapport à 135 ° / min; P = 0, 0119) (Fig. 3B). Aucune différence significative n'a été observée pour le nombre de cellules dans le surnageant après l'ensemencement des cellules (Fig. 3B). Différents temps d'incubation ont également été testés après l'ensemencement des cellules dans les chambres (4 h, 8 h, 16 h et 22 h). Un temps d'incubation de 22 h s'est avéré être le meilleur paramètre ici car plus de cellules adhèrent à l'échafaudage sur tout autre temps d'incubation testé (P < 0,0001). De plus, plus de cellules ont été comptées dans le surnageant après 4 h d'ensemencement par rapport à tout autre moment (P <0, 0001), indiquant que les cellules n'avaient pas le temps d'adhérer correctement à l'échafaudage et étaient toujours dans le milieu de culture (Fig. 3C). Dans l'ensemble, les paramètres d'ensemencement cellulaire optimaux étaient de 0,15 M/mL de cellules à une vitesse de 90°/min pendant 22 h à 37 °C.

Nombre de cellules adhérant sur les échafaudages et dans le surnageant en fonction de la concentration cellulaire, de la vitesse du système d'ensemencement et du temps d'incubation. (A) Trois concentrations cellulaires en millions de cellules par millilitre de milieu (M/mL) ont été évaluées en ensemençant des cellules à 90°/minute pendant 22 h ; (B) trois vitesses de système (°/min) ont été évaluées en ensemençant des cellules de 0,15 M/mL pendant 22 h ; (C) quatre temps d'incubation (heures) ont été analysés en ensemençant 0,15 M/mL à 90°/min. Pour les analyses statistiques, une ANOVA à deux voies avec le test de comparaison multiple de Tukey a été réalisée. Le graphique (A–C) montre la boîte et les moustaches avec max et min. n = 4–5/groupe. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001. ns non significatif.

La nouvelle technique d'ensemencement sphérique a été comparée à une méthode d'ensemencement dynamique et statique. Tout d'abord, la distribution cellulaire sur les échafaudages PETG après l'ensemencement peut être observée avec une coloration au bleu Rhodanile (Fig. 4A). Des distributions cellulaires uniformes apparentes peuvent être observées sur les mandrins en utilisant la technique sphérique par rapport à d'autres techniques d'ensemencement (Fig. 4A et Fig. 1 supplémentaire). De plus, aucune différence statistiquement significative entre l'ensemencement sphérique et les autres techniques n'a été mesurée après le décompte approprié des cellules adhérant aux échafaudages après la période d'ensemencement de 22 h (Fig. 4B). Remarquablement, le TEBV-A, produit à l'aide du système sphérique décrit, était statistiquement supérieur au TEBV-A produit à l'aide des autres techniques d'ensemencement après une période de maturation de 42 jours de culture après l'ensemencement initial (P <0, 05 et P <0, 0001) (Fig. 4C, D), indiquant qu'une distribution uniforme peut être importante pour la production de TEBV-A plus épais.

Distribution cellulaire et viabilité dans le TEBV-A post-ensemencé et mûri produit par différentes techniques d'ensemencement. (A) Photographie de cellules colorées au Rhodanile Blue sur un échafaudage PETG après l'ensemencement. Barre d'échelle = 1 cm ; (B) nombre de cellules adhérant à l'échafaudage après une période d'ensemencement de 22 h ; (C) Épaisseurs de tissu TEBV-A (µm) mesurées après une période de maturation de 42 jours ; (D) Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) de coupes histologiques collectées à partir de TEBV-A mûri produit à l'aide de différentes techniques d'ensemencement (sphérique, dynamique et statique). Barre d'échelle = 100 µm ; (E, F) Test vivant/mort sur des cellules récoltées TEBV-A post-ensemencées analysées par cytométrie en flux ; (G, H) Essai vivant/mort sur des cellules récoltées TEBV-A matures. (B,C) Boîte et moustaches avec max et min. Pour les analyses statistiques, un test de Kruskal-Wallis avec le test de comparaison multiple de Dunn a été réalisé. n = 4–24. (F,H) Barres empilées avec écart type. Pour les analyses statistiques, une ANOVA à deux voies avec le test de comparaison multiple de Tukey a été réalisée. n = 5. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001. ns non significatif.

Un autre aspect important à considérer ici et à comparer entre les différentes méthodes d'ensemencement est la viabilité cellulaire. Par conséquent, des tests de cytométrie en flux vivants/morts ont été utilisés pour quantifier la viabilité cellulaire après les périodes d'ensemencement de 22 h (post-ensemencement) et de maturation de 42 jours. La viabilité post-ensemencement s'est avérée significativement plus élevée lors de l'utilisation du système d'ensemencement sphérique par rapport aux autres méthodes d'ensemencement ; dynamique (P <0,001) et statique (P <0,001) (Fig. 4E, F et Supplémentaire Fig. 2A). Bien que considérablement plus faible, aucune différence de viabilité cellulaire n'a été mesurée après la période de maturation de 42 jours après l'ensemencement dans l'une des techniques d'ensemencement testées (Fig. 4G, H et Supplémentaire Fig. 2B). La viabilité cellulaire inférieure mesurée dans le TEBV-A mûri pourrait simplement s'expliquer ici par la digestion enzymatique de 30 minutes nécessaire pour récolter les cellules de l'ECM pour l'analyse par cytométrie en flux ; cette étape n'est pas nécessaire en période post-ensemencement. Dans l'ensemble, une distribution cellulaire plus uniforme, un TEBV-A plus épais, ainsi qu'une viabilité cellulaire améliorée ont été mesurés à l'aide du système rotatif sphérique développé par rapport à d'autres techniques d'ensemencement dynamiques et statiques.

Des TEBV-A ramifiés entièrement biologiques, fabriqués avec des fibroblastes humains, ont été produits en utilisant les paramètres d'ensemencement cellulaire optimaux prédéterminés. Après une période d'incubation d'ensemencement cellulaire de 22 h, les chambres d'ensemencement ont été démontées du système. Les échafaudages ensemencés de cellules ont ensuite été placés dans des plaques de culture et ont été maintenus en culture pendant 42 jours. Les épaisseurs de tissu ont été mesurées à l'aide d'un micromètre laser sur chaque branche (Fig. 5A). Aucune différence statistiquement significative n'a été trouvée pour les trois branches des TEBV, ce qui indique une distribution uniforme des cellules tout au long des mandrins ensemencés (Fig. 5A, B). Pour produire des TEBV à géométrie complexe tels que des échafaudages en forme de Y, il était en effet crucial de concevoir un système d'ensemencement cellulaire permettant une distribution uniforme des cellules tout au long des échafaudages et en particulier au niveau du site ramifié/jonction. Le TEBV-A ramifié a tous montré des cellules uniformément réparties au site de jonction critique macroscopiquement (Fig. 5C, D). De plus, les épaisseurs de tissu ont été mesurées à partir de coupes histologiques des branches et des jonctions (Fig. 5E, F) et aucune différence statistiquement significative n'a été trouvée (Fig. 5G).

Caractérisation macroscopique et microscopique du TEBV-A ramifié produit avec le système d'ensemencement rotatif développé. (A) Photographie d'une géométrie "Y" TEBV-A sur un échafaudage PETG ramifié ; (B) épaisseur de tissu des trois branches (I, II, III) de TEBV-A en µm. N = 4, n = 4 ; (C) photographie en gros plan de la jonction TEBV-A sur l'échafaudage (D) et coupée de l'échafaudage ; (E) coloration H & E de la branche et (F) jonction de l'échantillon TEBV-A coupé de l'échafaudage ; (G) Épaisseur tissulaire des coupes histologiques des branches et de la jonction de TEBV-A en µm. n = 12. Les flèches indiquent le site de jonction. Pour les analyses statistiques, un test de Kruskal-Wallis avec le test de comparaison multiple de Dunn a été effectué pour le graphique (B) et un test t de Welch pour le graphique (G). Le graphique (B, G) montre un nuage de points avec des barres et un écart type. Barre d'échelle = 100 µm. ns non significatif.

Dans cet article, nous avons réussi à concevoir et construire un système d'ensemencement cellulaire sphérique rotatif capable de produire des TEBV biologiques de petit calibre à géométrie complexe, entièrement constitués de cellules humaines. Les paramètres d'ensemencement des cellules ont été optimisés pour améliorer la distribution et l'adhérence cellulaires tout au long des zones d'échafaudage, même au point de ramification/jonction critique des TEBV en forme de "Y" de preuve de concept conçus. Par rapport à d'autres approches d'ensemencement dynamiques et statiques, notre nouvelle méthode d'ensemencement sphérique permet aux cellules d'être réparties plus uniformément tout au long du TEBV produit, de démontrer une viabilité cellulaire post-ensemencement plus élevée et de produire des tissus plus épais. Le système décrit comprenait des chambres d'ensemencement usinées sur mesure et facilement stérilisables contenant des échafaudages PETG traités aux UV-C conçus pour s'adapter à l'intérieur des chambres d'ensemencement. Il convient de noter que les chambres d'ensemencement peuvent facilement être repensées avec d'autres géométries/spécifications pour s'adapter à différentes formes, tailles et angles de vaisseaux sanguins à la bifurcation.

Une concentration cellulaire de 0,15 M/mL lors de l'ensemencement initial des chambres, combinée à une rotation aléatoire dans toutes les directions (x, y et z) pendant 22 h à une vitesse de 90°/min se sont révélées être les paramètres d'ensemencement optimaux pour favoriser l'adhérence et la distribution des cellules le long de l'échafaudage PETG. Après la période d'incubation de 22 h dans les chambres d'ensemencement, les échafaudages ensemencés de cellules ont été retirés des chambres et cultivés pendant 42 jours dans un milieu de culture pour favoriser la production, l'assemblage et la maturation d'ECM des TEBV. La cinétique des interactions entre les cellules et les échafaudages solides a suivi le modèle de Langmuir, pour lequel ses trois hypothèses ont été adaptées à la culture cellulaire : (i) les cellules ne peuvent pas s'attacher pour former plus qu'une monocouche ; (ii) les cellules peuvent se fixer à toutes les surfaces de l'échafaudage ; (iii) les cellules peuvent adhérer à l'échafaudage indépendamment des cellules déjà attachées jusqu'à ce qu'une monocouche soit atteinte17,18. Le traitement UV-C du PETG est connu pour favoriser l'adhérence cellulaire en modifiant les groupes carbonyle du plastique, qui à leur tour augmentent les propriétés hydrophiles du matériau14,19,20,21. Conformément à la théorie de Langmuir, le mouvement de rotation du système d'ensemencement dynamique décrit facilite les interactions cellule-échafaudage sur toute la surface du mandrin en plastique traité, a permis une meilleure adhérence et distribution des cellules7,8,22. En effet, le mouvement aléatoire à 360° de ce nouveau système a permis aux cellules de rencontrer toutes les parties de l'échafaudage à géométrie complexe pendant la période d'ensemencement. Cela a été indiqué par les épaisseurs de tissu uniformes mesurées le long des branches du TEBV en forme de "Y". La troisième hypothèse de Langmuir implique qu'une fois qu'une monocouche est atteinte, les cellules cessent de se fixer indépendamment à l'échafaudage et commencent à interagir avec d'autres cellules attachées. Cette augmentation des interactions cellule-cellule au fil du temps peut avoir favorisé le détachement des cellules de l'échafaudage et expliquer pourquoi un nombre égal ou inférieur de cellules a été récupéré du PETG avec une densité cellulaire plus élevée, atteignant ainsi un plateau17,21.

La vitesse médiane du système a été considérée comme optimale pour un ensemencement cellulaire à 90°/min. Alors que toutes les vitesses testées étaient relativement faibles, le système devait être suffisamment rapide pour maintenir les cellules en suspension dans le milieu pendant toute la durée de l'ensemencement, mais suffisamment lent pour que les cellules interagissent correctement et se fixent au plastique. Une période d'ensemencement plus longue de 22 h a également été nécessaire pour augmenter l'attachement cellulaire. Il a également été démontré que des vitesses lentes pendant de plus longues périodes favorisent une meilleure fixation des cellules dans d'autres modèles23,24. Les paramètres d'ensemencement cellulaire, tels que la vitesse, la densité cellulaire et le temps, étant dépendants du type cellulaire (interaction cellule-échafaudage, adhérence cellulaire, capacité de production de matrice), doivent donc être optimisés pour chaque modèle d'ingénierie tissulaire et type de cellule à ensemencer9,25,26,27,28. Nous avons estimé la vitesse de sédimentation (V) dans les chambres d'ensemencement à 2,5 µm/s pour la population de fibroblastes testée, en utilisant la loi de Stokes en mécanique des fluides V = (g(ρp − ρf)d2)/18μ calculée à l'aide des constantes suivantes : (gravité (g : 9,81 m/s2), densité cellulaire (ρp : 1050 kg/m3), densité du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) ( ρf : 1007 kg/m3), diamètre des cellules fibroblastes (d : 10 µm) et viscosité DMEM (μ : 0,00093 Pa s) 29, 30. Bien que lente, cette vitesse de sédimentation des fibroblastes combinée au mouvement de rotation aléatoire de la sphère pendant 22 h permet une distribution uniforme des cellules sur l'échafaudage dans les chambres d'ensemencement en rotation, malgré la complexité de la géométrie 30, 31.

L'utilisation de moteurs à balais, pour faire tourner la sphère dans une rotation aléatoire de 360° à basse vitesse, est associée à certaines limitations car elle a atteint le maximum de sa capacité. La mise à niveau vers des servomoteurs permettrait une rotation plus précise tout en éliminant le risque que les moteurs s'arrêtent d'eux-mêmes en raison d'une surchauffe, d'une résistance accrue et d'une diminution de la tension. Ce système d'ensemencement de cellules rotatives utilise un potentiomètre pour réguler la tension des moteurs et dicter la vitesse de rotation. L'ajout d'un système de microcontrôleur et d'un affichage électronique permettrait un meilleur réglage de la tension et une vitesse de rotation plus précise lors de l'ensemencement des cellules.

Par rapport à d'autres techniques d'ensemencement, la méthode du système d'ensemencement sphérique développée a permis une distribution uniforme des cellules sur les échafaudages PETG ainsi que de produire un TEBV-A mûri plus épais après 42 jours de culture cellulaire, quel que soit le nombre de cellules initialement adhérées aux échafaudages pendant la période d'ensemencement. Une distribution cellulaire plus uniforme peut alors aider à la maturation des tissus et par conséquent améliorer la sécrétion et l'assemblage de la MEC32,33,34. Il a été démontré que les interactions cellule-cellule et cellule-ECM dans l'ingénierie tissulaire sont nécessaires dans la modélisation des maladies pour mieux représenter la diaphonie entre les cellules, les compositions tissulaires et le microenvironnement associé aux pathologies humaines complexes11,35,36.

Bien que le modèle TEBV complet intègre une adventice (fibroblastes), une média (cellules musculaires lisses) et une tunique intima (cellules endothéliales), l'état actuel des modèles TEBV ramifiés évolue rapidement des prothèses vasculaires ramifiées aux stents vasculaires ramifiés en clinique aux tubes de collagène ramifiés avec des cellules endothéliales et aux greffons vasculaires ramifiés imprimés en 3D4,37,38,39. À notre connaissance, nous sommes la première équipe de recherche à produire un modèle TEBV ramifié de petit calibre entièrement biologique de l'adventice sans matériel exogène. Fait particulièrement intéressant, le site de jonction critique est resté intact et ne s'est pas arraché après le démontage de l'échafaudage. Ce système innovant rend possible la production de tissus d'une épaisseur suffisante permettant leur manipulation, observation et étude avec une seule feuille de fibroblastes monocouches, bien qu'elle ne puisse pas encore être perfusée. Plusieurs ensemencements cellulaires séquentiels pourraient être la prochaine étape appropriée pour fabriquer des TEBV multicouches plus épais40.

La production de TEBV de petit calibre dérivés de patients avec une géométrie complexe peut être un moyen innovant de modéliser diverses maladies vasculaires. Par exemple, les TEBV construits en forme de Y seraient un modèle in vitro unique pour étudier les anévrismes intracrâniens (IA), se produisant principalement dans les bifurcations du cercle de Willis chez les individus affectés41,42. L'AI est un trouble cérébrovasculaire dans lequel la faiblesse de la paroi des vaisseaux sanguins cérébraux provoque un gonflement localisé43. Les AI présentent un taux de mortalité de 50 % et un taux de morbidité de 30 à 50 % chez les survivants, suite à sa rupture44. L'utilisation de TEBV en forme de Y cultivés dans un bioréacteur permettant de générer un flux sanguin artificiel mais physiologique sera d'un intérêt particulier dans l'étude de l'IA et de l'hémodynamique. Étant donné que la composante génétique des IA n'est pas encore très bien comprise, les TEBV multicouches et ramifiés dérivés de patients pour produire des vaisseaux sanguins entièrement reconstitués avec intima, média et adventice seraient également d'un grand intérêt pour l'étude des mécanismes pathogéniques et physiopathologiques associés aux IA.

En conclusion, nous avons présenté un système innovant d'ensemencement cellulaire rotatif, facile à utiliser, lavable et stérilisable, permettant de produire cinq TEBV tubulaires de petit calibre de l'adventice avec une géométrie complexe. Dans l'ensemble, le système d'ensemencement et les chambres ont été conceptualisés et fabriqués sur mesure pour être d'un fonctionnement simple. Le système décrit aura donc des impacts considérables pour les recherches futures étant donné que des cellules uniformément réparties tout au long des échafaudages lors de l'ensemencement cellulaire sont cruciales pour la culture 3D et l'ingénierie tissulaire.

Le logiciel CREO 5.0 (PTC, Boston, MA, USA) a été utilisé pour produire la CAO du système d'ensemencement avant la construction (Fig. 1A). La sphère était constituée de deux moitiés d'une sphère creuse en acrylique de 10 pouces de diamètre (California Quality Plastics, Ontario, CA, États-Unis) (Fig. 1B, C). Deux anneaux de fermeture imprimés en 3D ont été fabriqués à partir de filament PETG de 1,75 mm (Filaments.ca, Mississauga, ON, Canada), imprimés sur une imprimante 3D H800 (Afinia, Chanhassen, Min, USA) et collés aux moitiés de sphère avec de l'élastomère de qualité médicale Silastic™ (Dupont, Wilmington, NC, USA). Les anneaux de fermeture sont maintenus ensemble par des vis à tête hexagonale en acier inoxydable (McMaster-Carr, Chicago, IL, USA) vissées dans l'anneau PETG mâle et verrouillées dans l'anneau PETG femelle. Des plaques imprimées en 3D ont été conceptualisées et imprimées comme décrit précédemment pour maintenir en place les chambres d'ensemencement. Les plaques ont été fixées à la sphère avec des supports imprimés en 3D qui ont été collés au centre de la moitié de la sphère avec du Silastic™. Pour s'assurer que les chambres d'ensemencement restent en place pendant la rotation du système, une pression a été ajoutée via des ressorts en acier inoxydable résistant à la corrosion (McMaster-Carr). La plaque de support a été fabriquée en alliage d'aluminium 6061-T6 (Acier Picard, Levis, QC, Canada) à l'aide d'une fraiseuse 3 axes (Fryer Machine Systems, Patterson, NY, USA) (Fig. 1d). Deux moteurs à balais DC 12 V, 10 RPM (RobotShop, Mirabel, QC, Canada) ont été placés perpendiculairement l'un à l'autre, pour assurer le mouvement de rotation du système. Deux supports de moteur et trois supports de type roulement à billes en aluminium ont été fabriqués sur mesure et fixés à la plaque. Des billes en acier inoxydable résistant à la corrosion ont été placées à l'intérieur des paliers de support pour assurer une rotation correcte de la sphère et offrir un support supplémentaire (McMaster-Carr). Les composants électroniques pour fournir le courant et contrôler la vitesse ont été placés à l'intérieur d'un boîtier en PETG imprimé en 3D. Les moteurs étaient connectés à des interrupteurs à 3 positions séparés, un potentiomètre de 25 k, un régulateur de tension linéaire (Digi-Key, Thief River Falls, Min, USA) et une alimentation AC/DC 5 V de qualité médicale (Newark, Mississauga, ON, Canada) qui se branche dans une prise murale 125 V ordinaire. Toutes les photos et vidéos ont été prises via la mini caméra iPhone 12 (Apple, Cupertino, CA, USA).

Le logiciel CREO 5.0 (PTC) a également été utilisé pour produire la CAO des chambres d'ensemencement (Fig. 2A – C). Les chambres étaient constituées de deux moitiés distinctes en polycarbonate faites sur mesure (Groupe PolyAlto, Québec, QC, CA). Des empreintes en forme de Y ont été découpées dans les deux moitiés à l'aide de la fraiseuse à trois axes (Fryer Machine Systems). La moitié inférieure était entourée d'un joint torique en silicone souple haute température en forme de Y, d'une largeur fractionnaire de 3/32 (McMaster-Carr) pour sceller les moitiés de la chambre d'ensemencement les unes aux autres (Fig. 2D). La moitié supérieure a été faite avec trois ouvertures qui servent d'orifices d'ensemencement scellés avec des joints toriques en silicone souple haute température, une largeur fractionnaire de 3/64 et des vis de réglage à pointe conique en acier inoxydable 18-8, filetage M4 × 0,7 mm, 4 mm de long (McMaster-Carr). Les échafaudages démontables en forme de Y ont été découpés sur mesure avec une fraiseuse 5 axes (Fryer Machine Systems, Patterson, NY, USA) à partir de tiges PETG de 4,8 mm de diamètre (McMaster-Carr) et maintenus ensemble par 18-8 goupilles cylindriques en acier inoxydable, 1/32" de diamètre, 1/4" de long (McMaster-Carr). Ces échafaudages sont placés au centre des chambres d'ensemencement, à l'intérieur de l'empreinte en forme de Y, et les deux moitiés sont jointes ensemble et sont entièrement fermées à l'aide de vis à tête hexagonale en acier inoxydable 316, filetage M4 × 0,7 mm, 16 mm de long avec rondelles en acier inoxydable 316 à usage général pour taille de vis M4, diamètre intérieur de 4.300 mm, diamètre extérieur de 8 mm et écrous hexagonaux en acier inoxydable 316, super résistants à la corrosion, M4 × 0. Filetage 7 mm (McMaster-Carr) (Fig. 2E). Toutes les photos ont été prises via la mini caméra iPhone 12 (Apple).

Des fibroblastes dermiques humains ont été isolés comme décrit précédemment45 et cultivés dans du DMEM (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; VWR, Radnor, PA, USA), 100 UI/mL de pénicilline G et 25 μg/mL de gentamicine (Sigma-Aldrich, Kawasaki, OL, Japon). L'utilisation de cellules humaines a été approuvée par le comité d'éthique de la recherche du CHU de Québec (numéro de protocole : 1115C & 1115D) et l'individu a été recruté sur une base volontaire après consentement éclairé. Les cellules ont été ensemencées avec 10 ml de milieu de culture DMEM dans les chambres contenant des tiges de PETG traitées aux UV-C de 4, 8 mm de diamètre (McMaster-Carr). Les chambres d'ensemencement ont été placées dans le système d'ensemencement rotatif et maintenues à 37 ° C pour les expériences en aval. Le traitement UV-C a été effectué comme décrit précédemment pendant 30 min/côté (tour de 90°) puis recouvert de 0,2 % de gélatine (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)14. Pour déterminer la concentration cellulaire optimale à utiliser lors de l'ensemencement initial, trois conditions ont été testées (0,10, 0,15 et 0,30 M/mL) et ont été ajoutées aux chambres cellulaires, puis placées dans le système rotatif à vitesse moyenne pendant 22 h. Trois vitesses de rotation différentes ont également été testées pour mieux optimiser les paramètres d'ensemencement des cellules. Des chambres ont été ensemencées avec des fibroblastes (0,15 M/mL), installés dans la sphère tournante pendant 22 h à une vitesse de rotation de 63°, 90° ou 135°/minute, ces vitesses ont été considérées comme les vitesses minimale, médiane et maximale atteignables par la sphère. Différentes périodes d'incubation après l'ensemencement des cellules ont également été testées. Des chambres d'ensemencement ont été ensemencées avec des fibroblastes (0,15 M/mL), placés dans la sphère à une vitesse de rotation de 90°/minute pendant 4, 8, 16 et 22 h.

Les surnageants ont été récupérés et centrifugés à 300 xg pendant 10 min à la fin de chacun de ces temps d'incubation. Les cellules non attachées et centrifugées restantes présentes dans les surnageants ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu DMEM et comptées à l'aide d'un compteur de cellules (Beckman Coulter, Pasadena, CA, USA). Des bâtonnets de PETG ensemencés de cellules ou des échafaudages en forme de Y ont d'abord été incubés avec de la trypsine 0, 05% (Fisher Scientific) / EDTA 0, 01% (Teknisciences, Terrebonne, QC, Canada) pendant 10 min pour laisser les cellules se détacher, puis centrifugés à 300 × g pendant 10 min. Les cellules récupérées ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu puis comptées via un compteur de cellules Coulter (Beckman Coulter).

Des fibroblastes dermiques humains ont été cultivés dans un milieu DMEM avec 10 % de FBS et le cocktail antibiotique. Des cellules de 0,15 M/mL ont été ensemencées dans des chambres d'ensemencement sur mesure via les trous d'ensemencement. Un total de 10 ml de milieu de culture DMEM a été injecté dans les chambres d'ensemencement contenant des échafaudages en forme de Y fabriqués à partir de tiges de PETG de 4, 8 mm de diamètre (McMaster-Carr). Les échafaudages en PETG ont été prétraités aux UV-C puis enduits de 0,2 % de gélatine (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) comme décrit précédemment14. Pour l'ensemencement sphérique, les chambres ensemencées ont ensuite été placées dans la sphère à 90°/minute pendant 22 h dans une pièce à 37 °C. Pour un ensemencement dynamique, les chambres ensemencées ont été placées sur un agitateur orbital (BlotBoy, Benchmark Scientific, Sayreville, NJ, USA) pendant 22 h dans un incubateur à 37 °C, 8 % de CO2. Pour l'ensemencement statique, les chambres ont été placées directement dans un incubateur à 37 ° C et 8 % de CO2 pendant la période d'ensemencement de 22 h. Les échafaudages ensemencés de cellules ont ensuite été récupérés et placés dans une plaque de culture cellulaire de 500 cm2 contenant un milieu de culture DMEM, additionné de 50 μg/mL d'acide ascorbique (Sigma), pendant 42 jours dans un incubateur à 37 °C, 8 % de CO2. Le milieu a été changé tous les 2 à 3 jours et les échafaudages ont été tournés à 180° chaque jour de changement de milieu de culture.

Des images macroscopiques d'échafaudages PETG en forme de Y ensemencés de cellules ont été prises avec une mini caméra iPhone 12 (Apple). Les épaisseurs de tissu sur les trois branches différentes de l'échafaudage en forme de Y ont été mesurées avec un micromètre laser de haute précision (Keyence, Mississauga, ON, Canada). Quatre mesures différentes sur chacune des branches de quatre TEBV différents en forme de Y ont été utilisées pour l'analyse statistique. Les TEBV ont été fixés dans du formol à 3,7 % pendant la nuit (ChapTec, Montréal, QC, Canada). Des photographies macroscopiques des sites de jonction des TEBV biopsiés ont également été prises avant l'analyse histologique. Des coupes transversales fixes de TEBV de 10 μm ont ensuite été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) comme décrit précédemment36. Les images microscopiques ont été acquises et mesurées dans des conditions de fond clair à l'aide d'un microscope droit (AxioImager.M2; Carl Zeiss Microscopy, Jena, TH, Allemagne). Pour l'analyse de la distribution, les échafaudages ensemencés ont été fixés dans du formol à 3,7 % pendant 30 min, puis placés dans une coloration au bleu de Rhodanile pendant 15 min, puis rincés avant de les laisser sécher avant de prendre des photographies macroscopiques de tous les côtés de l'échafaudage.

Après les périodes d'ensemencement de 22 h, les surnageants ont été récupérés et centrifugés à 300 xg pendant 10 min pour chaque technique d'ensemencement. Les bâtonnets de PETG ensemencés de cellules ont été incubés avec de la trypsine 0, 05% (Fisher Scientific) / EDTA 0, 01% (Teknisciences) pendant 10 min pour laisser les cellules se détacher, puis centrifugés à 300 × g pendant 10 min. Les cellules récupérées du surnageant et des échafaudages ont été incubées pendant 15 min avec Calcein AM 2,5 nM (Thermo-Fisher) pour marquer les cellules vivantes et Ethidium homodimer-1 4 μM (Thermo-Fisher) pour marquer les cellules mortes. Les cellules ont été immédiatement analysées avec un cytomètre en flux BD FACSMelody™ (BD Biosciences) et les données ont été traitées à l'aide du logiciel FlowJo™ v9 (Ashland, OR, USA). Pour les tissus matures, ils ont d'abord été récupérés des échafaudages et placés dans une solution de digestion de 5,7 U/ml de collagénase H (Sigma-Aldrich) dans de l'accutase (Sigma-Aldrich) à 37 °C avec une agitation de 300 tr/min pendant 30 min. Les cellules ont été filtrées à travers un tamis cellulaire de 40 μm (Fisher Scientific) et centrifugées à 300 x g pendant 10 min. Enfin, les cellules ont été analysées comme décrit ci-dessous.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 9.0 (GraphPad, San Diego, CA, USA). Les données présentées dans des graphiques en boîte et moustaches avec max et min ont été analysées par ANOVA à deux voies avec le test de comparaison multiple de Tukey ou par le test de Kruskal-Wallis avec le test de comparaison multiple de Dunn. Les données présentées sous forme de diagramme de dispersion avec moyenne et écart type (SD) ont été analysées par le test de Kruskal-Wallis avec le test de comparaison multiple de Dunn ou par le test t de Welch. Les données présentées par des barres empilées avec SD ont été analysées par le test de Kruskal-Wallis avec le test de comparaison multiple de Dunn. Une valeur P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

L'étude a été approuvée par nos comités d'éthique institutionnels (Comité d'éthique de la recherche du CHU de Québec; numéros de protocole 1115 C et 1115 D. Pour plus d'informations, veuillez contacter ([email protected]). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices nationales de la politique des trois conseils : Éthique de la recherche avec des êtres humains et approuvées par le comité d'éthique du CHU de Québec – Université Laval.

Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets impliqués sur une base volontaire dans l'étude.

Les données présentées dans cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

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Nous tenons à remercier Marc-André Campagna, André Chamberland, Patrick Dupuis, Frédéric Morin et Pierre Carrier de l'atelier de génie mécanique de l'Université Laval. Nous tenons à remercier Todd Galbraith, Vincent Clément, Isabella Bienjonetti et Richard Brodeur pour leur aide technique et leurs précieux conseils.

Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds Nouvelles frontières en recherche (NFRF) et des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). JR est bénéficiaire du NFRF. FG-L. est récipiendaire des chaires de recherche du Canada. VR est récipiendaire d'une bourse doctorale du Fonds de la Recherche du Québec en Santé (FRQS).

Département de chirurgie, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, QC, Canada

Alyssa Brodeur, Vincent Roy, Lydia Touzel Deschênes & François Gros-Louis

Division de médecine régénérative, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, Québec, QC, Canada

Alyssa Brodeur, Vincent Roy, Lydia Touzel Deschênes, François Gros-Louis & Jean Ruel

Département de génie mécanique, Faculté des sciences et de génie, Université Laval, Québec, QC, Canada

Alexandre Winter et Jean Ruel

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Conceptualisation, AB, AW, VR, FG-L. et JR ; méthodologie, AB, AW, VR, LT-D., FG-L. et JR ; logiciels, AB et AW ; validation, RV, FG-L. et JR ; analyse formelle, AB et VR ; enquête, AB, AW et LT-D. ; ressources, LT-D., FG-L. et JR ; conservation des données, AB et AW ; rédaction—préparation du brouillon original, AB ; rédaction—révision et édition, AB, AW, VR, FG-L. et JR ; visualisation, AB et VR ; supervision, RV, FG-L. et JR ; gestion de projet, FG-L. et JR ; financement acquisition, FG-L. et JR Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à Jean Ruel.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Vidéo supplémentaire 1.

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Réimpressions et autorisations

Brodeur, A., Winter, A., Roy, V. et al. Système d'ensemencement cellulaire rotatif sphérique pour la production de vaisseaux sanguins de petit calibre issus de l'ingénierie tissulaire avec une géométrie complexe. Sci Rep 13, 3001 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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Reçu : 08 septembre 2022

Accepté : 10 février 2023

Publié: 21 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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